刘红军，谢爱香，张希杰，葛美层，朱君，孙志明

    (河南省濮阳市中医院1.检验科；2.妇产科；3.病理科，河南 濮阳457000)

    卵巢癌属于一种常见的妇科恶性肿瘤,在女性恶性肿瘤发病中位居第三,目前关于卵巢癌的发病机制尚不明确，大部分学者认为，卵巢癌发病与患者的年龄、精神状况、环境、遗传等相关[1]。卵巢癌患者发病较为隐匿,早期患者缺乏典型的临床症状,晚期患者表现为腹胀，下腹部出现包块，患者病程短，死亡率较高。目前手术联合化疗治疗中晚期卵巢癌，但受化疗耐药性和复发的影响，患者预后差，5年的生存率较低[2]。选择有效的参与卵巢癌发生、进展的相关分子，对患者来说具有重要意义，也是临床研究的重点。RAGE主要在多种细胞表面进行表达的分子，在多种肿瘤中均有发现，参与肿瘤细胞增殖、凋亡、等过程[3,4]。研究认为，RAGE基因参与肿瘤生长过程,在肿瘤治疗中发挥着重要作用。本文旨在研究沉默RAGE对人卵巢癌细胞株增殖、凋亡能力及周期分布的影响,为临床治疗卵巢癌寻找有效的靶向治疗途径。

    1 材料与方法

    1.1 材料 研究细胞及主要试剂：人上皮性卵巢癌SKOV-3细胞主要由(中国典型培养物保藏中心提供)。主要试剂：CCK-8、Transwell试剂盒(碧云天生物公司提供)；Tris-HCl缓冲液(Hyclone公司)；Bcl-2、Bax、CDK4、Cyclin D1一抗(北京中山生物公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养 15ml离心管中加入8ml的15%胎牛血清培养基给予备用,取出人上皮性卵巢癌SKOV-3细胞，37℃水浴预热培养基,液氮中将细胞取出后快速置入37℃水浴进行解冻,使用镊子将冻存管夹住后，晃动，管口高于水平面，防止污染。加入5ml的培养基进行细胞重悬，1000rmp离心处理5min，将上清液摒弃后，再次加5ml的培养基进行细胞重悬,置入培养瓶中，轻轻混合均匀，在37℃，5%的二氧化碳培养箱中培养，第二天，更换培养基继续培养，观察其贴壁情况，及时更换培养基。

    1.2.2 慢病毒载体构建及分组 严格按照Gen-Bank最新RAGE基因库目标序列可能出现的干扰位点,进行设计shRNARAGE。RAGE序列：5'-GA TCCGGGCCGGACAGAAGCTTGGA和5'-TCCAAG CTTCTGTCCGGCCTTTTTT-3。对照引物序列为5'-CGATACTGAACGAATCGAT-3'。正反链混合后将退火缓冲液加入其中，95℃反应4min,冷却至室温,产生双链。采用Eco31Ⅰ酶切线性化质粒pGenesil-1 ......