李美 楼姣英

    宫颈人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染的主要病机为湿毒浸淫、结聚于子门,金哲教授抓住毒邪结聚这一病机关键,以攻毒散结为治法,研制出宫颈外用中药清毒栓。前期课题研究发现清毒栓含药血清通过调控P53基因表达[1]、调控P53泛素化降解途径[2]、下调MDM2基因[3]、减少B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达、增多Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X,Bax)表达而使人子宫颈鳞癌细胞(SiHa细胞)凋亡[4]等分子生物学机制,达到抑制肿瘤的目的。本课题体内实验结果表明,清毒栓可以抑制荷瘤小鼠外周血中Treg细胞,从而逆转微环境中的免疫抑制[5]。为了验证Treg细胞的改变是否与Zeste同源物增强子2(enhancer of Zeste homolog 2,EZH2)调控的叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Forkhead boxP3,Foxp3)表达变化有关,在前期基础上,本实验以jurkat细胞为研究对象,观察清毒栓含药血清对jurkat细胞相关基因及蛋白的表达影响,进一步探索清毒栓提取物治疗宫颈HPV感染的免疫学机制,为该药临床应用提供更充足的实验学依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物及细胞株

    SPF级SD大鼠20只,体质量280～300 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司[京动许字(2000)第004号总049号]。人宫颈癌SiHa细胞、jurkat细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所。

    1.2 实验药物

    清毒栓(专利号:ZL201010109562.1),主要组成为紫草、莪术、黄柏等。本科研使用的试药由中国中医科学院中药研究所制作,通过特定工艺制作清毒栓药液,包括分别醇提紫草、油提莪术、水煎黄柏等。实验药物为中药饮片提取制成清毒栓药液,不是清毒栓提纯。消毒栓药液浓度相当于中药饮片4.2 g/mL,高温消毒后于4℃冰箱密封保存。饮片均购自北京同仁堂药店。

    1.3 主要实验仪器

    超净工作台(苏州集团安泰空气技术有限公司,SW-CJ-1FD);离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,HI650);低速离心机(Eppendorf,5702R);PCR仪(东胜创新生物科技有限公司,EDC-810);实时荧光定量PCR仪(ABI,7500);Multiskan MK3酶标仪(MD,Spectramac M3);流式细胞仪(Beckmancoulter,CytoFLEX)等 ......