加样时差对竞争抑制法检测抗-HBc的影响因素探讨(2)
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参见附件(1331KB，2页)。
1.3.2 B组标本加入后放置37℃水浴不同时间组将1∶30稀释后的84例阴性标本分别加入7块酶标反应板,每块板37℃水浴分别放置0、5、10、15、20、30、40 min后加入酶标试剂,其余步骤同上。用于观察加样后放置37℃水浴不同时间对结果的影响。
1.3.3 C组酶标加入后放置37℃水浴不同时间组准备7块酶标反应板,先加入酶标试剂,37℃水浴分别放置0、5、10、15、20、30、40 min后,再加入1∶30稀释后的40例阳性标本,其余步骤同上。用于观察先加入酶标试剂后放置37℃水浴不同时间再加标本对结果的影响。
1.3.4 D组标本与酶标试剂混匀后加入放置室温不同时间组准备84个试管,加入1∶30稀释好的84例标本及酶标试剂,混匀,再将混匀物分别加入7块酶标反应板,室温分别放置0、5、10、15、20、30、40 min,其余步骤同上。用于观察同时加入标本与酶标试剂放置不同时间对实验结果的影响。
2 结果
按照时差试验A组检测84例抗-HBc阴性血清标本,在25℃室温条件下加入标本后放置5 min,再加入酶标试剂,即有2例阴性标本出现假阳性,随着加样后室温放置时间的延长,光密度(OD值)逐渐减低,假阳性明显增多,放置20 min时,假阳性数已达放置时间10 min组的2倍,放置40 min后,本试验组84例阴性标本仅剩68例为阴性结果。时差试验B组,加入标本后放置37℃水浴条件下,假阳性例数较室温下有所增加,加样放置5 min即出现4例假阳性,40 min时84例阴性标本仅剩60例为阴性结果。时差试验C组,检测40例抗-HBc阳性血清标本,37℃水浴加酶10 min后加样,有37例阳性,加酶40 min后加样,仅有27例阳性,且OD值逐渐增加。时差试验D组,将标本与酶标试剂事先混匀后同时加入(达到公平竞争),室温放置5～40 min,试验结果无明显变化。具体结果见表1。
3 讨论
EIA一步法检测抗-HBc的实验操作时差现象普遍存在[2]。实验A、B组结果表明,25℃及37℃即时加酶与加样40 min后加酶比较,OD值随时间减低,阳性率增加,反应温度越高,假阳性率越高。这是由于目前酶免疫竞争抑制法检测抗-HBc的原理是采用基因工程重组HBcAg包被反应板,加入待测标本同时加入抗-HBc-HRP,使待测标本中的抗-HBc与抗-HBc-HRP公平竞争结合固相上的HBcAg。而在实际工作中,尤其面对许多中小型医院的实验室,还没有普及全自动仪器,需要采用手工加样,而在加样时往往是1份标本同时加完5个项目后再加下一个标本,这样就存在标本越多加样时间越长,加入抗-HBc-HRP的时间就越晚的问题,这样势必造成先加入的血清标本抗-HBc优先较长时间地与固相上的HBcAg结合,形成明显的与抗-HBc-HRP的不公平竞争,造成特异性的抗-HBc总抗体假阳性增多。实验C组40例抗-HBc阳性血清标本37℃水浴加酶40 min后加样有27例阳性,且OD值逐渐增加,出现假阴性结果。这3组试验都证实了加样时差对竞争抑制法检测抗-HBc的重要影响。
针对加样时差造成的对抗-HBc结果的影响,笔者按照实验原理进行了D组试验,实验结果显示将稀释标本与抗-HBc-HRP混匀后同时加入,室温放置5～40 min,实验结果无明显变化,证明这种结合达到一个动态平衡,不会因在室温中放置时间的延长而使动态平衡失衡。为了充分证实这一点,笔者将临床抗-HBc总抗体的加样方式改为先将1∶30稀释标本与酶标试剂混匀,再加入到酶标反应板中,经过几千例临床标本的检测证实这种方法明显减少了假阳性的发生,确保了检测结果的真实性。
抗-HBc总抗体阳性是既往感染的标志,亦可是急性HBV感染的早期[3]。任何假阳性结果不仅会误导临床的诊治,而且给患者造成精神和经济上的负担。因此为了减少加样时差造成的影响,笔者建议:对于手工加样时不要同时对5个检测项目加样,应单项目分别加样。采用尽可能公平竞争的加样方式完成实验,该方法在临床上具有一定的可操作性。对于HBV5项指标检测结果比较少见的模式及抗-HBc单独阳性的标本,包括弱阳性标本应严格复检,确保检验的质量。建议厂家改进检测方法,即选用HBCAb包被,在加样结束后再加HBcAg及酶标志物,以避免不公平竞争及加样时差的影响。
[参考文献]
[1]梁宝铎,曾真.乙型肝炎血清学标本间非特异性交叉反应的研究[J].中华医学检验杂志,1995,18 (4):232-235.
[2]滕龙,陈钢.操作时差对酶免疫竞争法检测乙型肝炎病毒核心抗体结果的影响[J] ......
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