双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案快速筛查肠道传染病菌(2)
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1.4.3 使用培养法对逐份样品进行检测将每份肛拭子标本37℃预增菌6 h后，分别分装于SC和GN增菌液中，各增菌18 h后，SC增菌液转种BS琼脂平板和HE琼脂平板，GN增菌液转种HE琼脂平板和EMB琼脂平板，将上述平板培养18 h后，挑取各平板上生长的疑似沙门菌或志贺菌菌属的菌落进行染色镜检后，进行纯培养和初步生化试验，再将纯培养物使用半自动细菌生化鉴定仪进行生化试验，用血清学试验进行沙门菌或志贺菌菌属菌属和型别的鉴定。每个步骤的培养温度均为37℃。检测过程质量控制：操作过程均无菌操作，并使用没有接种任何物质的培养基做为空白对照，使用大肠杆菌ATCC25922标准菌株做为阴性对照，使用甲型副伤寒沙门氏菌CMCC(B)50093标准菌株做为沙门氏菌检测的阳性对照，使用痢疾志贺氏菌CMCC(B)51252标准菌株为志贺氏菌检测的阳性对照，保证结果的准确性。
1.5 统计学处理
数据的比较采用配对卡方检验。
2 结果
双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案检出沙门菌15份，志贺菌3份，阳性标本共18份，阳性率为0.36%。培养法检出沙门菌12份，志贺菌2份，阳性标本共14份，阳性率为0.28%。
双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案检测阳性而培养法检测阴性的标本有4份，双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案检测阴性而培养法检测阳性的标本有0份。
以培养法做为“金标准”进行分析，双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案的灵敏度为100%，特异性为99.64%(灵敏度=A/(A+B)×100%=14/(14+0)×100%=100%，特异性=D/(C+D)×100%=4982/(18+4982)×100%=99.64%)。双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案和培养法两种检测方法的阳性率经配对χ2检验，两者的阳性率结果无显著性差异(P>0.05)。见表1。
双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案在5 h内可完成整个检测过程，每天300份标本的工作量只需1人便可完成，使用PCR仪器自动化检测，减少了工作环节上工作人员对标本的接触，也减少了玻璃器皿的使用，在生物安全方面保护了工作人员，每份标本的试剂耗材成本约为8元。培养法在需5 d以上才可完成整个检测过程，每天300份标本的工作量需4人共同工作才能完成，工作人员需直接接触标本和使用玻璃器皿，生物安全方面需特别谨慎操作，每份标本的试剂耗材成本约为7.8元。两种方法总体比较，双色实时荧光PCR结合标本混合检测方案同培养法相比，具有省时、省力、操作安全，成本接近等优点，两种检测方法的阳性率无统计学差异。见表2。
3 讨论
双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案，采用了双色实时荧光PCR方法，可降低使用单一试剂的成本，对两种细菌同时进行检测，可节省两种细菌分开进行检测的时间。使用标本混合检测方案进行检测，可节约试剂成本和节省逐份标本检测的时间，两者结合还可减少工作人员的工作量，使用PCR仪器自动化检测，减少了工作环节上工作人员对标本的接触，也减少了玻璃器皿的使用，在生物安全方面保护了工作人员。
在从业人员肠道传染病菌检测中，双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案的灵敏度为100%，特异性为99.64%，结果准确特异，与邱亚群[4]、李光伟[5]、于新芬[6]、邓文星[7]和钟伟军[8]等对实时荧光定量PCR技术的研究结果相符，具有重要的检测诊断意义。
双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案和培养法两种检测方法的阳性率无统计学差异，成本接近，而且双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案比培养法具有省时、省力、操作安全等优点。综上所述，提示具有快速、准确、自动化和操作安全特点的双色实时荧光PCR方法结合标本混合检测方案可做为从业人员肠道传染病菌快速筛查的技术方法。
[参考文献]
[1]石晓路，扈庆华，张佳峰,等.多重实时PCR快速同时检测沙门氏菌和志贺氏菌[J].中华流行病学杂志,2006,27(12):1053-1056.
[2]李义强,杨福荣,孔繁玲,等.标本混合检测与逐份样品采用PCR双色荧光检测试剂检测结果比较[J].中国现代医药杂志,2010,12(3):7-8
[3]李义强,何卓雅,梁治贤,等.实时荧光定量PCR检测技术操作规程探讨[J].中国卫生检验杂志,2009,19(4A)：87-89.
[4]邱亚群,扈庆华,汪武新,等.荧光PCR对从业人员肠道致病菌筛查的评价[J] ......
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