酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞(2)
2.2 平滑肌免疫组化鉴定
α肌动蛋白免疫组化染色可见胞浆内含有与细胞长轴相平行的黄色颗粒，证实为平滑肌细胞，细胞纯度在95%以上。
3 讨论
随着动物组织细胞培养技术和培养基质量的不断提高，目前对于血管平滑肌细胞的体外分离培养有很多报道，但对老龄SD大鼠的血管平滑肌细胞的报道少见，由于老龄动物组织细胞较年轻的动物组织细胞不易培养，寻找一种稳定的对老龄SD大鼠的血管平滑肌细胞培养的方法是非常重要的，笔者经过多次预试验，包括组织植块培养法、悬浮组织块培养法、酶消化分散细胞原代培养法，发现植块培养法和悬浮组织块培养法成功率低，不易掌握，不能稳定地获得实验所需的细胞，即使成功，但耗时长，并且易产生成纤维细胞等杂质，0.2%Ⅱ型胶原酶消化分细胞原代培养法可稳定、大量的获得实验所需的细胞。这可能是因为老龄动物血管平滑肌细胞出现增龄变化，分离后休眠期长，进入分裂的细胞而不易在体外生长增殖，而且老龄动物动脉血管中膜、胞外基质增加，血管平滑肌细胞被增高的弹力膜和胶原纤维分隔，组织植块培养法中细胞爬出阻力增大，酶消化法可将胞外基质消化，细胞易游离出来。总之，成功的老龄SD大鼠血管平滑肌细胞培养需要重视以下几点：①快速、仔细、彻底剥离血管中膜层，以获得高纯度的平滑肌组织。②组织块应尽量剪碎，便于很好地消化，消化程度是以肉眼不见消化液中的组织块，而是均匀黏稠状的混悬液为宜，在相差显微镜下可见大小成团细胞和单个细胞，如果12～18 h都不能很好地消化组织块，应及时更换胶原酶。③高质量的Ⅱ型胶原酶和胎牛血清是成功的关键。④分离组织时动作一定要轻柔，避免对血管组织的过度损伤。⑤在开始培养的72 h内，必须绝对静置，以防刚贴壁的细胞重新漂浮而死亡。⑥传代时掌握好消化的时机已是成功的关键，当细胞变成不透亮并细胞间有间隙出现，即可终止消化，消化后以成片成团的细胞成活率为高。⑦细胞培养全过程中要求严格的无菌操作[5]。
本实验用0.2%Ⅱ型胶原酶(用含的20%胎牛血清DMEM/F12培养基配制)消化老龄SD大鼠主动脉平滑肌细胞，并综合运用自然纯化法、差速贴壁法纯化获得高纯度血管平滑肌细胞，经鉴定，第5代细胞纯度可达95%以上，本方法稳定易掌握，具有一定的推广价值，为心血管系统病研究提供稳定的细胞来源。
[参考文献]
[1]司徒镇强.细胞培养[M].2版.北京:世界图书出版社,2007.
[2]方正旭,王伶,刘东.关于动脉平滑肌细胞培养的几个问题[J].江西医学院学报,2002,42(5):157-158.
[3]Diluozzo G,Bhargava J,Poweell RJ.Vascular smooth muscle cell effect on endothelial cell endothelin-l production[J].J Vasc Surg,2000,3(4):781-789.
[4]薛庆善.体外培养的原理与技术[M].北京:科学出版社,2001.
[5]费雷谢尼,张静波,徐存拴(译).动物细胞培养-基本技术指南[M].4版.北京:科学出版社,2004:116-120.
(收稿日期：2010-12-15), http://www.100md.com(王明勇,陈枫,陈庄)
α肌动蛋白免疫组化染色可见胞浆内含有与细胞长轴相平行的黄色颗粒，证实为平滑肌细胞，细胞纯度在95%以上。
3 讨论
随着动物组织细胞培养技术和培养基质量的不断提高，目前对于血管平滑肌细胞的体外分离培养有很多报道，但对老龄SD大鼠的血管平滑肌细胞的报道少见，由于老龄动物组织细胞较年轻的动物组织细胞不易培养，寻找一种稳定的对老龄SD大鼠的血管平滑肌细胞培养的方法是非常重要的，笔者经过多次预试验，包括组织植块培养法、悬浮组织块培养法、酶消化分散细胞原代培养法，发现植块培养法和悬浮组织块培养法成功率低，不易掌握，不能稳定地获得实验所需的细胞，即使成功，但耗时长，并且易产生成纤维细胞等杂质，0.2%Ⅱ型胶原酶消化分细胞原代培养法可稳定、大量的获得实验所需的细胞。这可能是因为老龄动物血管平滑肌细胞出现增龄变化，分离后休眠期长，进入分裂的细胞而不易在体外生长增殖，而且老龄动物动脉血管中膜、胞外基质增加，血管平滑肌细胞被增高的弹力膜和胶原纤维分隔，组织植块培养法中细胞爬出阻力增大，酶消化法可将胞外基质消化，细胞易游离出来。总之，成功的老龄SD大鼠血管平滑肌细胞培养需要重视以下几点：①快速、仔细、彻底剥离血管中膜层，以获得高纯度的平滑肌组织。②组织块应尽量剪碎，便于很好地消化，消化程度是以肉眼不见消化液中的组织块，而是均匀黏稠状的混悬液为宜，在相差显微镜下可见大小成团细胞和单个细胞，如果12～18 h都不能很好地消化组织块，应及时更换胶原酶。③高质量的Ⅱ型胶原酶和胎牛血清是成功的关键。④分离组织时动作一定要轻柔，避免对血管组织的过度损伤。⑤在开始培养的72 h内，必须绝对静置，以防刚贴壁的细胞重新漂浮而死亡。⑥传代时掌握好消化的时机已是成功的关键，当细胞变成不透亮并细胞间有间隙出现，即可终止消化，消化后以成片成团的细胞成活率为高。⑦细胞培养全过程中要求严格的无菌操作[5]。
本实验用0.2%Ⅱ型胶原酶(用含的20%胎牛血清DMEM/F12培养基配制)消化老龄SD大鼠主动脉平滑肌细胞，并综合运用自然纯化法、差速贴壁法纯化获得高纯度血管平滑肌细胞，经鉴定，第5代细胞纯度可达95%以上，本方法稳定易掌握，具有一定的推广价值，为心血管系统病研究提供稳定的细胞来源。
[参考文献]
[1]司徒镇强.细胞培养[M].2版.北京:世界图书出版社,2007.
[2]方正旭,王伶,刘东.关于动脉平滑肌细胞培养的几个问题[J].江西医学院学报,2002,42(5):157-158.
[3]Diluozzo G,Bhargava J,Poweell RJ.Vascular smooth muscle cell effect on endothelial cell endothelin-l production[J].J Vasc Surg,2000,3(4):781-789.
[4]薛庆善.体外培养的原理与技术[M].北京:科学出版社,2001.
[5]费雷谢尼,张静波,徐存拴(译).动物细胞培养-基本技术指南[M].4版.北京:科学出版社,2004:116-120.
(收稿日期：2010-12-15), http://www.100md.com(王明勇,陈枫,陈庄)