4个地区独一味的ITS基因片段序列分析(2)
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1材料与方法
1.1 材料来源
所有材料均来源自野外，本试验选用了不同产地的4个独一味居群，所采集样本，-70℃冰箱中保存待用。所1.2 实验方法
1.2.1 基因组DNA提取
分别使用CTAB法、苯酚法、高盐低PH法、植物基因组小量抽提试剂盒(Plant DNA Mini Kit)(上海生工)提取植物基因组DNA，2%琼脂糖电泳检测，-20℃冰箱保存，备用。
1.2.2 引物设计
在保守区设计5条寡核苷酸引物。引物序列如下:
P-P1：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；
P1：5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGGA-3′；
P2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′；
P3：5′-GCATC GATGA AGAACGCAGC-3′；
P4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；
以上引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.3 扩增策略
先用引物P-P1和P4扩增rDNA基因内转录间隔区全序列；其扩增产物经纯水稀释后，在分别应用引物P1和P2扩增ITS1序列；引物P3和P4扩增ITS2。有此完成套叠式聚合酶链式反应(nPCR)。
1.2.4 扩增循环
按下述程序进行扩增：①94℃预变性2 min；②93℃变30 s；③55℃退火30 s；④72℃延伸1 min；⑤重复步骤②～④35次；⑥最后一个循环72℃延伸 5 min；2%琼脂糖凝胶电泳检测产物DNA；置于多影像凝胶成像仪下观察结果，并拍照，保存；ITS区纯化、测序通过PCR扩增所得产物送上海生工纯化、测序。
2 数据分析及系统树构建
本试验将所获得的ITS碱基序列同时选用唇形科与独一味不同属的植物Phlomis x margaritae、Phlomis purpurea、Phlomis crinita subsp.Mauritanica、Phlomislychnitis、Ajugadecumbens、Rubiteucrispalmata、Cardioteucriscordifolia Schnabeliaoligophylla、Scutellariabaicalensis、Holocheilalongipedunculata Glech omahederacea、Salviaplebeian、Salviasplendens、Perillafrutescens的序列作为外类群，经Clusta 1x排序,用MEGA3软件基于Kimura-2-parameter模型计算遗传距离(表2)，并采用近邻归群(Neighbor-Joining，NJ)法构建系统发育树(图1)，系统树各分枝的置信度自举检测(bootstrap)2000次。各类群间的平均遗传距离为0.1757。各类群ITS长度和序列中的质量分数(表3)。
3 讨论
目前利用ITS序列分析技术进行分子鉴定和种群遗传多样性的研究已有不少报道，如谢晖等[4]用ITS序列9种柴胡属植物进行了分子鉴定学研究；林昕等[5]利用ITS序列作为遗传标记分析了来自3个不同地区的西施舌的遗传变异情况，还基于ITS序列分析了西施舌在蛤蜊科和双壳贝类中的分子系统进化地位。笔者通过PCR扩增，采用Chromas(version2.22)软件从序列峰图中提取核苷酸序列，ClustalX软件进行多序列比对分析，独一味的ITS的序列长度为670bp，ITS1序列长度约为210bp左右，ITS1序列长度约为240bp左右，序列分析结果表明，这4个产地独一味个体之间遗传差异较小，共计22个变异位点，9个信息位点，643个保守位。其中，甘南玛曲与西藏林芝独一味的遗传差异和遗传距离小，四川若尔盖道班与四川若尔盖热当坝遗传差异和遗传距离小，但与甘南玛曲和西藏林芝独一味遗传差异和遗传距离相对较大，两两之间为遗传相似度为97.80%～99.80%。
采用MEGA3.1软件，以唇形科内与独一味不同属植物为外类群，基于ITS序列分别构建了来自不同地区独一味NJ分子系统树分子进化树表明：四川若尔盖道班和四川若尔盖热当坝独一味在所做的3种进化树中均形成一支，甘南玛曲和西藏林芝独一味均形成另外一支。系统进化树一致表明四川若尔盖道班与四川若尔盖热当坝遗传距离较近 ......
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