间接竞争酶联免疫吸附法检测骨肽的研究(1)
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[摘要] 目的：研究酶联免疫吸附法对骨肽的检测。方法：考察抗原浓度、竞争时间、二抗浓度、工作时间、显色时间等对间接竞争酶联免疫吸附结果的影响。结果：检测抗原浓度为 0.25 μg/ml，竞争时间30 min，酶标二抗的最佳工作浓度为1∶400，二抗反应时间40 min，显色时间15 min。结论：本实验通过优化间接酶联免疫检测条件，建立了骨肽的间接竞争酶联免疫吸附检测方法，试验结果稳定，且精确度较好。
[关键词] 骨肽；间接酶联免疫吸附；含量；测定
[中图分类号] R927 [文献标识码] C [文章编号] 1674-4721(2011)11(c)-051-02
Research of indirect enzyme-linked immunosorbent assay of ossotide
SHEN Fei, FENG Jing, DOU Wenxuan, YU Hui
Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co., Ltd., Jiangsu Province, Nanjing 210038, China
[Abstract] Objective: To study the enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of bone peptide. Methods: Investigated the antigen concentration, competition time, the second antibody concentration, working hours, the color time on indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay results. Results: The detection of antigen concentration was 0.25 μg/ml, competition time was 30 min, HRP secondary antibody concentration of 1∶400 of the best work, two anti-reaction time was 40 min, color time was 15 min. Conclusion: In this study, by optimizing the indirect enzyme-linked immunosorbent assay conditions, the establishment of bone peptide competition ELISA indirect detection methods, test results are stable, and there is better accuracy.
[Key words] Bone peptide; Indirect enzyme-linked immunosorbent assay; Content; Determination
骨肽是采用哺乳动物的四肢骨，经一系列工艺提取而得的分子大小不规则的动物多肽。骨肽含多种骨代谢的活性肽类，具有调节骨代谢，刺激成骨细胞增殖，促进新骨形成的作用[1]。目前常用的骨肽含量测定方法主要是根据识别蛋白质多肽来进行定量。酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是酶免疫测定技术中应用最广的技术，但在骨肽检测方面尚未见报道，本研究选用骨肽注射液为原料，建立ELISA检测法，进行骨肽的检测。
1 仪器与药品
骨肽注射液(南京新百药业有限公司，H20003427)。抗骨肽抗体(一抗，以纯化的骨肽为免疫原，常规免疫动物制得)，羊抗兔(酶标二抗，碱性磷酸酶标记)。DG3022A酶标检测仪，南京华东电子集团医疗装备有限责任公司。
2方法与结果
2.1 ELISA溶液系统
包被液：0.05 mol/L碳酸盐缓冲液；洗涤液：0.01 mol/L磷酸盐缓冲液；封闭液：含0.5%牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液；底物溶液，1 mg/ml；对硝基苯磷酸酯(pNPP)，10%二乙醇胺，0.5 mM氯化镁，pH9.8；终止液：2 mol/L NaOH溶液。
2.2 测定方法
以碳酸盐缓冲液包被稀释的检测抗原(骨肽)于酶标板，每孔100 μl，置湿盒于4℃过夜，封闭液封闭60 min，洗涤液洗涤3次，加入稀释的一抗，每孔100 μl，于37℃温育，洗涤3次，加入稀释的酶标二抗，每孔100 μl，于37℃温育，洗涤4次，加入底物溶液显色，用终止液终止反应，于310 nm波长处测定吸光度(A)值，以有抑制样品孔的A值与无抑制样品孔的A值的比值为纵坐标，骨肽浓度的对数为横坐标作图，绘制标准曲线。
2.3 间接竞争ELISA法的优化
2.3.1 检测抗原包被浓度和抗血清浓度的选择 将检测抗原用包被液稀释成不同浓度的试剂，每一稀释度3个平行 ......
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