高效液相色谱法测定脉络宁颗粒中绿原酸含量
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[摘要] 目的 应用反相高效液相色谱法测定脉络宁颗粒中绿原酸的含量。 方法 以乙睛-0.4%磷酸溶液(13∶87)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为327 nm。采用C18化学键合硅胶为固定相，在327 nm进行测定。 结果 绿原酸在0.1～0.8 μg范围内线性关系良好，平均回收率为99.52%。 结论 该方法简便、可靠、准确，可用于该制剂的质量控制。
[关键词] 反相高效液相色谱法；脉络宁颗粒；绿原酸；含量测定
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2012)03(c)-0055-02
Determination of chlorogenic acid in Mailuoning granules by HPLC
HE Yuchuan GUO Lin XU Yanhong
Institute for Food and Drug Control of Jinzhou City in Liaoning Province, Jinzhou 121000, China
[Abstract] Objective To determine the content of chlorogenic acid in Mailuoning granules by reversed-phase high performance liquid chromatography. Methods C18 column was used with the mixture of acetonitrile-0.4% Phosphoric acid solution (13:87) as the mobilephase at a flow rate of 1.0 mL/min with the detection wavelength at 327 nm. Results The method proved to be linear over therange of 0.1-0.8 μg. The recovery of the assay was 99.52%. Coclusion The method appears to be simple, reliable, accurate and can be used to the quality control of the preparation.
[Key words] RP-HPLC; Mailuoning granules; Chlorogenic acid; Determination
脉络宁颗粒由金银花、牛膝 、玄参、石斛、等中药材经提取精制而成[1]，具有清热养阴，活血化瘀的功能，用于血栓闭塞性脉管炎，静脉血栓形成，动脉硬化性闭塞症，脑血栓形成及后遗症等。金银花主要活性成分为绿原酸，绿原酸含量测定方法成熟、简便准确，故采用《中国药典》2010版(一部)中金银花含量测定项下的方法和液相色谱条件[2]以及相关的文献[3-8]报道进行含量测定方法的研究，现报道如下：
1 仪器与试药
P200II高压恒流泵、UV200Ⅱ紫外可变波长检测器(大连依利特分析仪器有限公司)，千谱色谱工作站；绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号：110753-200413)；样品：脉络宁颗粒(江西银涛药业有限公司；批号：1110011、1111012、1111013)；乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：迪马C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：25℃；流动相：乙睛-0.4%磷酸溶液(13∶87)；流速：1.0 mL/min；检测波长：327 nm；进样量：10 μL。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3 000，分离度大于1.5。
2.2 溶液的制备
取本品0.6 g，精密称定，置具塞瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，塞紧后称定重量，超声5 min使其溶解，放置至室温，再称定重量，滴加50%甲醇补充至相同重量，滤过，取续滤液过0.45 μm滤膜，作为供试品溶液。取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并制备成每1毫升含40 μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。取不含有金银花的阴性样品，依上述供试品溶液制备法制得阴性对照溶液。
2.3 方法学考察
阴性干扰试验：精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL分别注入液相色谱仪，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上有相应的色谱峰，而阴性对照品溶液色谱中在此位置并无相应的色谱峰，证明本方法可行。色谱图见图1。
线性关系考察：取绿原酸对照品2.523 mg至25 mL容量瓶中加50%甲醇溶解并至刻度，摇匀，即得0.100 9 mg/mL的对照品储备液。分别精密量取上述对照品储备液1、2、4、6、8 mL至10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得不同浓度的线性关系对照品溶液，分别吸取上述各对照品溶液10 μL注入色谱仪中，测定峰面积，以绿原酸的量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线图，并计算回归方程。回归方程为y = 2 000 000x - 3 813.1，相关系数r = 0.999 95(n = 5)，说明绿原酸对照品进样量在0.1～0.8 μg范围内线性关系良好。
稳定性试验：取同一供试品(批号：1110011)依法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h时依法测定，结果供试品平均峰面积平均值为715 605，RSD为1.3%(n = 8)，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
精密度试验：取同一对照品溶液(含量40.35 μg/mL)连续进样依法测定。结果主成分峰面积平均值为781 234.5，RSD为0.8%(n = 6)，表明本方法的精密度较好。
重复性试验：取同一批样品(批号：1111012)依法制备供试品溶液，依法测定。结果样品平均含量为3.058 mg/g，RSD为1.1%，表明本方法重现性良好。
加样回收试验：取同一批号已知含量的样品(批号：1111012，含量为3.058 mg/g)0.3 g，6份，精密称定，置已经加了0.952 5 mg绿原酸对照品的三角锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，照样品制备方法制备，并测定绿原酸总量 ......
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