卵巢肿瘤干细胞中趋化因子的表达与细胞侵袭转移能力的关系(2)
取2×107细胞，PBS(磷酸盐缓冲液)洗2次，SIGMA Trizol试剂盒一步法提取卵巢肿瘤干细胞总RNA。Promega 反转录试剂盒进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，以tubulin作为内参照，取2.5 μL反转录PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙啶染色，紫外光检测仪观察PCR合成结果。引物(北京三博合成)：正向5’-TACCATGCCAGGGGATCA-3’，反向5’-CTTGGCCTGTGACTGTT-3’，PCR产物长度约为450 bp。同时也采用免疫荧光标记流式细胞术分析法检测卵巢肿瘤干细胞CXCR4的表达。
1.3 趋化活性检测
本组卵巢肿瘤干细胞达CXCR4体系趋化活性检测采用Transwell分析：细胞稳定生长至70%~90%融合时，PBS清洗两遍，然后用无血清培养液把多细胞组合培养成单细胞悬液，显微镜下计数细胞，PBS清洗浓度调至1×106细胞/mL。将Transwell侵袭小室放入24孔板内，卵巢肿瘤干细胞接种于Transwell侵袭小室的上室，每上室加0.2 mL单细胞悬液，下室加0.4 mL无血清培养液，然后分为5组：(1)上室为包含单细胞悬液的无血清培养液，下室纯为无血清培养液。(该组为对照组)(2)上室为包含单细胞悬液的无血清培养液，下室包含CXCL12(浓度为10 ng/mL)的无血清培养液。(3)上室为包含单细胞悬液的无血清培养液，下室为包含CXCL12(浓度为100 ng/mL)的无血清培养液。(4)上室为包含CXCR4中和抗体(浓度为10 μg/mL)的无血清培养液，下室为包含CXCL12(浓度为10 ng/mL)的无血清培养液。(5)上室为包含CXCR4拮抗剂AMD3100(浓度为10 μg/mL)和单细胞悬液的无血清培养液，下室为包含CXCL12(浓度为100 μg/mL)的无血清培养液。培养后将上面5种方法培养后的细胞用PBS冲洗2次，棉拭子擦去未侵袭转移的细胞，无菌风干后用0.1%结晶紫染色20 min，然后用自来水冲洗干净。400倍显微镜下每张切片随机记录3个视野的侵袭转移细胞数，然后进行平均统计，观察CXCR4的表达对卵巢肿瘤干细胞侵袭转移的影响。
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1.4 统计学处理
应用SPSS 15.0统计软件进行数据处理，侵袭转移数据均以均数±标准差(x±s)表示，两两比较应用χ2检验，P < 0.05代表差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CXCR4的表达
流式细胞术检测结果提示，CAOV-3卵巢细胞株表达中等量的CXCR4分子，RT-PCR则进一步证实该细胞存在一定量的CXCR4分子的转录。而在Anglne细胞中CXCR4无表达。具体情况见图1。
M：marker；1：CAOV-3；2：Anglne
图1 卵巢肿瘤干细胞中CXCR4及tubulin mRNA的表达
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2.2 CXCR4的表达对卵巢肿瘤干细胞侵袭转移的影响
对于CAOV-3/CXCR4细胞来说，当Transwell小室的下室中加入10 ng/mL的CXCL12时，发生侵袭转移的细胞数与对照组相比增多(P < 0.05)；100 ng/mL CXCL12加入使侵袭转移的细胞数更明显增多(P < 0.05)，也明显高于10 ng/mL CXCL12组；不过当上室加入10 ng/mLCXCR4中和抗体或10 μg/mL CXCR4拮抗剂AMD3100时，能抑制CXCL12对卵巢肿瘤干细胞的趋化性侵袭转移(P < 0.05)，同时拮抗剂AMD3100加入时下降趋势更加明显(P < 0.05)。具体情况见表1。
3 讨论
众所周知，肿瘤的发生转移是一个复杂的、微观的、多信号的连续多阶段过程，肿瘤发生转移过程涉及肿瘤干细胞的发生、成熟、运动、侵袭、转移、黏附和消亡。与其他多种类型的肿瘤细胞不同，卵巢肿瘤干细胞具有独特的侵袭转移规律，这种转移特性除了与患者自身原因有关外，卵巢肿瘤干细胞中的趋化因子发挥了重要的作用[3]。
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趋化因子(chemokines)是一类具有趋化作用的细胞因子，是指具有吸引白细胞移行到感染部位的一些低分子量趋化因子(多为8-10KD)的蛋白质(如IL-8、MCP-1等)，在炎症反应中具有重要作用[4]。趋化因子的主要作用是趋化细胞的迁移，细胞沿着趋化因子浓度增加的信号向趋化因子源处的迁徙[5]。有些趋化因子在免疫监视过程中控制免疫细胞趋化，如诱导淋巴细胞到淋巴结。有些趋化因子在发育中起作用；他们能刺激新血管形成；提供具体的关键信号而促成细胞成熟。其他趋化因子可以因应对细菌感染、病毒感染由多种细胞释放；也可以因非感染性的刺激如二氧化硅吸入，尿路结石等而释放。炎性趋化因子的主要作用是趋化白细胞从血循环到感染或组织损伤部位。有的趋化因子也可以促进伤口愈合[6]。
CXCR4是白细胞中的一种受体，在免疫系统中起着调整细胞运动的重要作用。当前大量的研究提示CXCR4有可能在肿瘤发生、侵袭转移中发挥重要的作用。Vanderbilt-Ingram癌症中心的科学家们发现，CXCR4作为受体，在神经胶质瘤的扩散过程中扮演着极其关键的角色[7]。但研究者们也表示，阻止CXCR4发挥受体的功能，虽然能大大削弱癌细胞扩散的能力，但不能完全制止它们的扩散。国外还有研究显示约80%卵巢肿瘤组织中有CXCL12的受体CXCR4的表达，在95%卵巢肿瘤腹水中发现CXCL12，而在正常卵巢上皮中却没有表达[8]。2010年10月8日报道，美国科学家在最新出版的《科学》杂志报告称，他们获得了CXCR4分子结构的图像，也了解了该分子的工作原理[9]。研究显示，CXCR4分子同艾滋病病毒(HIV)感染和癌症扩散有关，该分子会帮助HIV进入细胞，因此，阻断该分子有望治疗艾滋病和癌症。一般而言，CXCR4也有助于激活免疫系统并且刺激细胞运动，但是，当激活受体的信号没有被正确调制时，CXCR4会加速癌症的恶化和扩散[7]。本文流式细胞术检测结果提示，CAOV-3卵巢细胞株表达中等量的CXCR4分子，RT-PCR则进一步证实该细胞存在一定量的CXCR4分子的转录。而在Anglne细胞中CXCR4无表达[10]。, 百拇医药(李青 汪艳 张曦 朱慧芬 唐良萏)
1.3 趋化活性检测
本组卵巢肿瘤干细胞达CXCR4体系趋化活性检测采用Transwell分析：细胞稳定生长至70%~90%融合时，PBS清洗两遍，然后用无血清培养液把多细胞组合培养成单细胞悬液，显微镜下计数细胞，PBS清洗浓度调至1×106细胞/mL。将Transwell侵袭小室放入24孔板内，卵巢肿瘤干细胞接种于Transwell侵袭小室的上室，每上室加0.2 mL单细胞悬液，下室加0.4 mL无血清培养液，然后分为5组：(1)上室为包含单细胞悬液的无血清培养液，下室纯为无血清培养液。(该组为对照组)(2)上室为包含单细胞悬液的无血清培养液，下室包含CXCL12(浓度为10 ng/mL)的无血清培养液。(3)上室为包含单细胞悬液的无血清培养液，下室为包含CXCL12(浓度为100 ng/mL)的无血清培养液。(4)上室为包含CXCR4中和抗体(浓度为10 μg/mL)的无血清培养液，下室为包含CXCL12(浓度为10 ng/mL)的无血清培养液。(5)上室为包含CXCR4拮抗剂AMD3100(浓度为10 μg/mL)和单细胞悬液的无血清培养液，下室为包含CXCL12(浓度为100 μg/mL)的无血清培养液。培养后将上面5种方法培养后的细胞用PBS冲洗2次，棉拭子擦去未侵袭转移的细胞，无菌风干后用0.1%结晶紫染色20 min，然后用自来水冲洗干净。400倍显微镜下每张切片随机记录3个视野的侵袭转移细胞数，然后进行平均统计，观察CXCR4的表达对卵巢肿瘤干细胞侵袭转移的影响。
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1.4 统计学处理
应用SPSS 15.0统计软件进行数据处理，侵袭转移数据均以均数±标准差(x±s)表示，两两比较应用χ2检验，P < 0.05代表差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CXCR4的表达
流式细胞术检测结果提示，CAOV-3卵巢细胞株表达中等量的CXCR4分子，RT-PCR则进一步证实该细胞存在一定量的CXCR4分子的转录。而在Anglne细胞中CXCR4无表达。具体情况见图1。
M：marker；1：CAOV-3；2：Anglne
图1 卵巢肿瘤干细胞中CXCR4及tubulin mRNA的表达
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2.2 CXCR4的表达对卵巢肿瘤干细胞侵袭转移的影响
对于CAOV-3/CXCR4细胞来说，当Transwell小室的下室中加入10 ng/mL的CXCL12时，发生侵袭转移的细胞数与对照组相比增多(P < 0.05)；100 ng/mL CXCL12加入使侵袭转移的细胞数更明显增多(P < 0.05)，也明显高于10 ng/mL CXCL12组；不过当上室加入10 ng/mLCXCR4中和抗体或10 μg/mL CXCR4拮抗剂AMD3100时，能抑制CXCL12对卵巢肿瘤干细胞的趋化性侵袭转移(P < 0.05)，同时拮抗剂AMD3100加入时下降趋势更加明显(P < 0.05)。具体情况见表1。
3 讨论
众所周知，肿瘤的发生转移是一个复杂的、微观的、多信号的连续多阶段过程，肿瘤发生转移过程涉及肿瘤干细胞的发生、成熟、运动、侵袭、转移、黏附和消亡。与其他多种类型的肿瘤细胞不同，卵巢肿瘤干细胞具有独特的侵袭转移规律，这种转移特性除了与患者自身原因有关外，卵巢肿瘤干细胞中的趋化因子发挥了重要的作用[3]。
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趋化因子(chemokines)是一类具有趋化作用的细胞因子，是指具有吸引白细胞移行到感染部位的一些低分子量趋化因子(多为8-10KD)的蛋白质(如IL-8、MCP-1等)，在炎症反应中具有重要作用[4]。趋化因子的主要作用是趋化细胞的迁移，细胞沿着趋化因子浓度增加的信号向趋化因子源处的迁徙[5]。有些趋化因子在免疫监视过程中控制免疫细胞趋化，如诱导淋巴细胞到淋巴结。有些趋化因子在发育中起作用；他们能刺激新血管形成；提供具体的关键信号而促成细胞成熟。其他趋化因子可以因应对细菌感染、病毒感染由多种细胞释放；也可以因非感染性的刺激如二氧化硅吸入，尿路结石等而释放。炎性趋化因子的主要作用是趋化白细胞从血循环到感染或组织损伤部位。有的趋化因子也可以促进伤口愈合[6]。
CXCR4是白细胞中的一种受体，在免疫系统中起着调整细胞运动的重要作用。当前大量的研究提示CXCR4有可能在肿瘤发生、侵袭转移中发挥重要的作用。Vanderbilt-Ingram癌症中心的科学家们发现，CXCR4作为受体，在神经胶质瘤的扩散过程中扮演着极其关键的角色[7]。但研究者们也表示，阻止CXCR4发挥受体的功能，虽然能大大削弱癌细胞扩散的能力，但不能完全制止它们的扩散。国外还有研究显示约80%卵巢肿瘤组织中有CXCL12的受体CXCR4的表达，在95%卵巢肿瘤腹水中发现CXCL12，而在正常卵巢上皮中却没有表达[8]。2010年10月8日报道，美国科学家在最新出版的《科学》杂志报告称，他们获得了CXCR4分子结构的图像，也了解了该分子的工作原理[9]。研究显示，CXCR4分子同艾滋病病毒(HIV)感染和癌症扩散有关，该分子会帮助HIV进入细胞，因此，阻断该分子有望治疗艾滋病和癌症。一般而言，CXCR4也有助于激活免疫系统并且刺激细胞运动，但是，当激活受体的信号没有被正确调制时，CXCR4会加速癌症的恶化和扩散[7]。本文流式细胞术检测结果提示，CAOV-3卵巢细胞株表达中等量的CXCR4分子，RT-PCR则进一步证实该细胞存在一定量的CXCR4分子的转录。而在Anglne细胞中CXCR4无表达[10]。, 百拇医药(李青 汪艳 张曦 朱慧芬 唐良萏)