原代类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞及成熟细胞系生长特性的比较(2)
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参见附件。
1.2 实验器材
超净台(苏净安泰，BSC-1000A2)；台式离心机(环宇，YXJ-1)；倒置荧光显微镜(Leica，DMI3009b)；CO2生化培养箱(三洋，MCO-20AIO)。
1.3 实验试剂
1640培养液(Gibco，C22400，500 mL)：加胎牛血清(Hyclone，SV30087.02)55 mL，青链霉素(Hyclone，SV30010)5.5 mL
DPBS(Hyclone，C4190)；胶原酶(GIBCO，17100-017)；0.25%胰酶(Hycloe，SH30042.01B)。
1.4 实验方法
1.4.1 取材
手术室进行无菌取材后放入不含血清的培养基内，冰上保存，迅速转移至实验室。剔除脂肪及纤维组织，磷酸盐缓冲液(DPBS)清洗2～3遍，去除血污。将组织反复剪切成约1 mm×1 mm×1 mm的碎块，置于无菌瓶内。
1.4.2 消化及培养
用30倍体积0.5 mg/mL的胶原酶I 37℃消化1～2 h后，离心2次，去除脂肪及杂质。将沉淀悬浮至1640培养液(10%胎牛血清)中置于37℃、5%CO2孵箱内培养。待滑膜细胞70%～80%汇合成片，以2.5 g/L的胰蛋白酶溶液消化细胞，并按1∶6的比例传代。
1.4.3 原代RA FLS与成熟细胞系MH7A生长特性比较
1.4.3.1 形态观察 待原代RA FLS传代稳定后，取第3代细胞置显微镜下观察，从细胞形态，密度等方面与MH7A进行比较。
1.4.3.2 增殖速度比较 取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化RA FLS和MH7A，用新培养基制成细胞悬液后计数，均按照2×105接种25 cm2细胞培养瓶，观察细胞70%～80%汇合所需时间。
2 结果
2.1 细胞形态观察
培养4 h后，显微镜下观察细胞开始贴壁生长，分布均匀，初为圆型。24 h后观察，细胞生长状态良好，分离培养的原代RA FLS细胞呈现长梭形(图1和图2)。随着细胞不断分裂，增殖，逐渐增多，细胞相互接触交织成网状。MH7A与 原代RA FLS 形态上差别较大。MH7A呈三角形或不规则形，细胞易聚集成堆生长，且漂浮死细胞较多(图3)。
2.2 增殖速度比较
均按照2×105接种后，对2种细胞增殖速度进行记录比较。原代RA FLS到达 70%～80%汇合所需时间为4～5 d，而MH7A所需时间明显缩短，为2～3 d。
3 讨论
研究表明，FLS介导了关节破坏，在RA发病过程中起着至关重要的作用，因此FLS的研究也逐渐受到重视[9-10]。本研究中分离培养的原代RA FLS细胞为规则长梭形，与成纤维样细胞形态相符。且未见其他形态细胞，说明3代后细胞纯度较高。以原代分离培养的RA FLS为研究对象，可能更加贴近病患体内状态，但原代细胞来源有限，使用代次有限，给科学研究带来一定的困难。MH7A作为成熟细胞系，细胞形态有所改变，但增殖速度快，不受代次限制，也不失为RA相关疾病研究理想的实验材料来源。MH7A也存在一定局限性，正因其为细胞系，某些生物学特性可能发生改变，且无法反应原代细胞样本所代表的患者之间的个体差异。综合各因素，MH7A可作为RA相关疾病前期研究的理想材料，一定程度上反应RA FLS的各项指标。
对于FLS的特异分子标志尚无统一定论，但目前有些学者认为FLS细胞表面存在UDPGD， VCAM-1/CD106， DAF/CD55， cadherin -11(Cadherin-11)，Vimentin，Thy-1/CD90， proline hydroxylase，CD44等强阳性表达，可作为鉴别细胞种类的分子标志[11-12]。细胞在传代过程中表面分子标志表达可能发生变化，本研究下一阶段计划检测原代FLS和细胞系表面分子标志差异，以及对RA治疗药物的不同反应。此外，绘制原代RA FLS和MH7A生长曲线，以更精确反应二者增殖速度上的差别。全面了解FLS原代及细胞系生物学特性的差异，为FLS在RA疾病中的深入研究和应用奠定基础。
[参考文献]
[1] Jonsson B. Patient access to rheumatoid arthritis treatments[J]. The European Journal of Health Economics，2008，8(Suppl 2)：S35-S38.
[2] Neil Betteridge. Services For People With Rheumatoid Arthritis-International Comparisons[R]. London：National Audit Office，2009.
[3] Alamanos Y，Drosos AA. Epidemiology of adult rheumatoid arthritis[J]. Autoimmun Rev，2005，4(3)：130-136.
[4] 古洁若. 类风湿关节炎研究进展[J]. 实用医学杂志，2005，21(13)：1367.
[5] Gary S. Firestein，Ralph C. Budd，Edward D. Harris Jr，et al. Textbook of Rheumatology[M] ......
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