榄香烯乳对大肠癌HCT—116细胞侵袭及miR—155表达的影响(1)
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[摘要] 目的 观察榄香烯乳对人大肠癌细胞迁移、侵袭的影响，并探讨其可能机制。 方法 采用不同浓度的榄香烯乳处理人大肠癌HCT116细胞后，以划痕试验方法检测癌细胞迁移能力，以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力，采用荧光实时定量PCR方法检测癌细胞miR-155 mRNA水平。 结果 人大肠癌HCT116细胞经榄香烯乳处理后，迁移和侵袭力均明显下降，且呈剂量依赖性(P < 0.05)。榄香烯乳处理组miR-155 mRNA水平明显下调，且呈浓度依赖性。 结论 榄香烯乳可降低人大肠癌细胞侵袭能力，下调miR-155 mRNA表达是其重要机制之一。
[关键词] 大肠肿瘤；榄香烯乳；侵袭力；miR-155
[中图分类号] R735.3+4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2012)12(a)-0007-03
近年来，国内大肠癌发病率逐渐增高，寻找有效的治疗药物和治疗手段乃当务之急。榄香烯乳(elemene)是从中药温莪术提取的有效成分之一，临床应用已显示其具有较广泛的抗癌谱[1-5]。但是榄香烯乳调控癌细胞侵袭的分子机制尚不完全清楚。本课题组以大肠癌HCT-116细胞为模型，探讨了榄香烯乳对癌细胞迁移、侵袭的效应，并从micro RNA(miRNA)角度探讨其分子机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
榄香烯乳，购自华立金港制药有限公司；人大肠癌细胞系HCT-116，本院组织细胞生物库冻存；RNA提取试剂TriIzol购自美国Invitrogen公司；基底膜胶(Matrigel)购自BD公司；RPMI 1640、胎牛血清均购自Gibco公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及药物处理 人大肠癌HCT-116细胞置于含5%胎牛血清的RPMI-1640液中，在37°C CO2培养箱中常规培养。待细胞至对数生长期，采用不同浓度(10、20、40 μg/mL)的榄香烯乳处理，以RPMI-1640代替榄香烯乳处理细胞作为空白对照组，3复孔，备测。
1.2.2 癌细胞迁移检测 采用划痕法检测癌细胞迁移能力，具体步骤参照文献[6]方法进行。基本操作步骤如下：(1)先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5～1.0 cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。(2)同样方法培养细胞至对数生长期，消化、计数，使用培养基配制成浓度为8×105个/mL的细胞悬液， 6孔细胞培养板中每孔加入1 mL细胞悬液，放入37℃，5%CO2培养箱中培养直至细胞铺满单层。(3)用100 μL枪头沿培养板底部呈“一”字形划痕；用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。(4)弃去培养基，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，用培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入1 000 μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组。(5)6孔细胞培养板置于37℃ 5%CO2培养箱中培养24 h，拍照。
1.2.3 细胞侵袭检测 该试验在Transwell板上进行，具体步骤参照文献[7-8]方法进行。倒置显微镜(×100)观察穿过膜的细胞数。每张膜中央部分和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内穿过聚碳酸酯膜微孔的细胞数。
1.2.4 miR-155 mRNA水平检测 采用荧光实时定量PCR检测。采用Trizol方法抽提细胞总RNA抽提，采用试剂盒逆转录为cDNA。miR-155 定量PCR上游引物：5′-CGCGCTTAATGCTAATCGTGA-3′；下游引物：5′- GTGCAGGGTCCGAGGT -3′，大小为62 bp。内参GAPDH上游引物：5- CATCTTCTTTTGCGTCGCCA -3′；下游引物：5′- TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC -3′，大小为115 bp。循环条件及计算方法参照文献[9]进行。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学处理，所得到的数据均以均数±标准差表示，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 榄香烯乳对大肠癌细胞迁移的影响
采用划痕法观察榄香烯乳对癌细胞迁移的影响。与对照组癌细胞(图1A)比较，榄香烯乳处理组癌细胞迁移速度较慢，迁移距离明显低于空白对照组(图1B)，后者划痕两侧癌细胞已趋融合。
2.2 榄香烯乳对大肠癌细胞侵袭的影响
收集经榄香烯乳处理的HCT116细胞，采用Transwell检测癌细胞侵袭情况。对照组、不同浓度(10、20、40 μmol/L) 榄香烯乳处理组穿过滤膜的细胞分别为(43.8±1.7)、(31.6±1.6)、(18.5±1.5)和(8.8±1.2)个。统计学分析提示，细胞侵袭呈浓度依赖性减少(P < 0.05)。
2.3 榄香烯乳对大肠癌细胞miR-155 的影响
以榄香烯乳处理大肠癌HCT-116细胞后，采用荧光实时定量CR检测。结果发现，与对照组比较，榄香烯乳各处理组miR-155 mRNA水平明显下调，呈浓度依赖性(P < 0.05)。见图2。
3 讨论
迁移性是转移性癌细胞重要特征之一。在成体组织中大多数正常细胞不具有迁移性，而恶性肿瘤细胞一般具有十分活跃的迁移性 ......
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