复方金蟾胶囊对HepA肝癌腹水瘤及细胞周期的影响(1)
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[摘要] 目的 观察复方金蟾胶囊对小鼠移植性肝癌HepA腹水瘤的抑制作用。 方法 将50只 BALB/C小鼠随机分为模型组、对照组(环磷酰胺，CTX)、金蟾小剂量组、金蟾中剂量组和金蟾大剂量组，每组10只。采用移植性HepA肝癌腹水瘤模型，进行抑制肿瘤的实验；给药结束第3天，摘取小鼠肿瘤组织和胸腺组织计算抑瘤率和胸腺指数，用流式细胞仪观察肿瘤细胞周期及细胞凋亡情况；取血测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。 结果 与模型组比较，金蟾各剂量组均可以增加小鼠胸腺重量及胸腺指数(P < 0.01)，明显抑制肿瘤生长；与模型组比较，对照组的肿瘤细胞仅G2/M期比例增加(P < 0.05)，金蟾小剂量组仅 S期细胞比例增高(P < 0.05)；金蟾大剂量组G2/M期、S期细胞比例均高于模型组。 结论 复方金蟾胶囊对小鼠移植性HepA肝癌腹水瘤具有明显抑制作用。
[关键词] 肝癌；BALB/C小鼠；环磷酰胺；金蟾胶囊
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2012)12(a)-0012-03
随着工业化的进展的加速，各种污染就随之而来，癌症的发生率也逐步上升。在长江和黄海的交界的启海农村，肝癌成为最常见的恶性肿瘤。为此，国家专门设立江苏省启东肝癌研究所，以研究肝癌的起因、预防和治疗。目前治疗肝癌的方法很多，效果均不明显，尤其是晚期肝癌，生存期很难延长。开发传统中草药用来抗癌是当今肿瘤防治的趋势之一。 蟾蜍是指两栖纲蟾蜍科动物中华大蟾蜍，多产于江浙一带，以蟾蜍为来源的中药材有蟾酥、蟾皮、干蟾， 主要药用作用有强心、解毒、止痛、增强免疫等。其本身就有一定毒性，食用过量会导致死亡。所以，古代中医就有“以毒攻毒”的说法，用它来治疗恶性疾病。目前发现蟾蜍具有一定抗肿瘤的作用，启东肝癌研究所生产的复方蟾龙片，海门的蟾衣研究所生产的蟾衣制品，均为开发的蟾蜍产品，在临床抗肝癌治疗中，都取得了一定的效果。金蟾胶囊是本院自行开发研制，以中华大蟾蜍的新鲜蟾皮为主药，配以其他十几味珍贵中药精制而成的中药复方制剂。本研究复制肝癌模型，施以金蟾胶囊治疗，观察验证其抗肿瘤作用并探讨其作用机制，为该复方中药的临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
BALB/C小鼠50只，均为雄性，体重20～25 g，由南通大学医学动物实验中心提供，动物使用许可证号：SYXK(苏)2002—0022。瘤株采用HepA肝癌腹水瘤小白鼠，种鼠由中国科学院上海药物研究所提供。
1.2 仪器与试药
1.2.1 仪器 流式细胞仪：美国guava easyCyte 8系统；分析天平：梅特勒-托利多-30型；净化台：苏州净化设备公司 SW-CJ-2F型。
1.2.2 试药 金蟾胶囊：每粒含中药0.25 g，由南通大学药学院加工制备，批号：20110408；实验前将胶囊内容物用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)水溶液调配成3种不同浓度的混悬液，备用。环磷酰胺(CTX)：无锡恒瑞制药股份有限公司生产，批号：110211，实验时用注射用蒸馏水溶解配制。
1.3 方法
取出HepA肝癌腹水瘤小白鼠的腹水瘤，捣碎成溶液。吸取0.2 mL用16号针尖腹腔接种到 BALB/C小鼠的腹内，一共接种50只，第2天称重，随机分为5 组。(1)模型对照组：10只小鼠，用0.5%CMC溶液灌胃，剂量为1 mL/100 g小白鼠体重；(2)阳性对照组：10只小鼠，腹腔注射CTX，剂量为2 mg/100 g体重；(3)金蟾小剂量组：10只小鼠，用金蟾胶囊混悬液灌胃，剂量为40 mg/100 g体重；(4)金蟾中剂量组：10只小鼠，用金蟾胶囊混悬液灌胃，剂量为80 mg/100 g体重；(5)金蟾大剂量组：10只小鼠，用复方金蟾胶囊混悬液灌胃，剂量为120 mg/100 g。各组按照上述要求给药，每天1次，连续 10 d，到第11天处死。
1.4 观察指标
1.4.1 抑瘤率和胸腺指数 剥离皮下瘤块，用滤纸吸干净后称重，计算各组抑瘤率和胸腺指数。计算公式为胸腺指数=[胸腺质量(mg)/小鼠质量(g)]×10。抑瘤率=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重[1-2]。
1.4.2 小鼠TNF-a 浓度测定 在实验到第11天小鼠处死前，各组采用眼球摘取法取血1 mL，放置于冰箱0℃保存，24 h后，于1 500 r/min离15 min，取上清液，用波长450 nm酶联仪依序测量光密度(OD值)后换算血清中TNF-α浓度[3-4]。
1.4.3 金蟾胶囊对HepA肝癌腹水瘤细胞周期测定 各组小鼠处死后，立即打开腹部，剥离腹部肿瘤组织，放入少许磷酸盐缓冲液，将肿瘤组织用手术剪剪至浆糊状，再用200目尼龙筛过滤。然后将滤液用缓冲液PBS冲洗 3次，冲完后用600 r/min的转速离心2 min，除去大的细胞碎片。每根试管中加入70%乙醇1 mL，用于固定细胞，然后放置于低温冰箱-20℃冻存，24 h后溶解，离心去除乙醇，再用缓冲液PBS冲洗2次 ......
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