少突胶质细胞对大鼠脊髓脱髓鞘疾病的形态学实验研究(1)
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[摘要] 目的 探讨少突胶质细胞对大鼠脊髓脱髓鞘疾病的作用，进行大鼠脊髓组织的形态学的观察。 方法 选择30只大鼠，随机分为3组，每组10只，包括对照组、模型组、治疗组，除了对照组，其余两组按脊髓匀浆(GPSCH)与弗氏完全佐剂(CFA)均匀混合作为抗原致敏，制备EAE大鼠动物模型造模，治疗组造模后进行少突胶质细胞的移植治疗，用常规苏木精伊红(HE)染色及卢卡斯快蓝(LFB)髓鞘染色方法，观察3组实验中脊髓组织形态学变化。 结果 HE染色切片显示，模型组脱髓鞘大鼠脊髓内形态正常的神经元比较少，治疗组脱髓鞘大鼠脊髓白质内的少突胶质细胞数量明显多于模型组的数量。LFB髓鞘染色切片显示，模型组脱髓鞘大鼠脊髓可见片状且大小不等的脱髓鞘区，灰白质结构明显疏松、组织排列破坏，形成的空洞也较多、较大。治疗组脱髓鞘大鼠脊髓组织排列较紧密、间隙小，灰白质结构变得完整，其形成的空洞更小、更少。 结论 少突胶质细胞的移植对大鼠脊髓脱髓鞘疾病的组织学结构修复作用较好，为临床研究提供科学依据。
[关键词] 少突胶质细胞；脊髓脱髓鞘疾病；形态学；实验研究
[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2013)02(b)-0006-03
脊髓脱髓鞘疾病是一种常见的中枢神经系统疾病，可造成患者的感觉、运动功能严重障碍，临床治疗脊髓脱髓鞘的效果始终不令人满意[1]。少突胶质细胞死亡是脊髓轴突脱髓鞘改变的主要原因，补充丢失的少突胶质细胞可促进脱髓鞘脊髓神经功能的恢复[2]。因此，本实验通过建立脊髓脱髓鞘大鼠模型以及少突胶质细胞的移植，观察大鼠脊髓的形态学变化，验证少突胶质细胞对大鼠脊髓脱髓鞘疾病有恢复效果。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
成年SD健康大鼠30只，体重230～250 g，由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供。随机分3组，对照组、模型组、治疗组，每组10只。对照组为健康大鼠，模型组为EAE模型大鼠，以大鼠脊髓匀浆与弗氏完全佐剂均匀混合作为抗原佐剂乳化物，经戊巴比妥钠麻醉后(50 mg/kg，腹腔注射)，以预冷的冰生理盐水心脏灌注建模[3-4]。治疗组为建模第15天向硬膜内移植少突胶质细胞悬液的大鼠。以上各组8周后进行脊髓HE染色及LFB髓鞘染色切片的观察。
1.2 主要仪器设备和试剂
石蜡切片机(德国Leica)；倒置相差显微镜(德国Leica)；戊巴比妥钠(上海试剂一厂)；苏木精-伊红(北京华美生物)；卢卡斯快蓝染液(美国Sigma)；少突胶质细胞悬液，本实验前期制备。
1.3 实验方法
1.3.1 治疗方法
在建造EAE鼠模型第15天，经10%乌拉坦麻醉，将大鼠头水平定位，沿中线切开，以矢状缝和冠状缝交叉点旁的1 mm、后0.4 mm为定位点标记钻孔，用牙科取物针在硬膜上造一个小孔，经10 μL注射器以侧脑室为目标、注射深度3 mm的标准注射少突胶质细胞悬液(0.5 μL/min)，而后留针5 min，以明胶海绵填塞骨孔，缝合切口[5]。
1.3.2 大鼠脊髓标本制备
在少突胶质细胞移植治疗术8周后，3组大鼠用过量1%戊巴比妥钠经腹腔麻醉大鼠，将大鼠仰卧位固定在操作台上，安装好心脏灌注系统，通过心脏灌注系统加压注入0.9%氯化钠溶液，至右心耳流出体外的液体清亮时，改用4%PFA溶液继续快速灌注，待大鼠全身变硬后结束灌注，将整个胸段脊柱取下，用蚊式钳小心咬掉脊椎骨剥离脊髓。将大鼠的脊髓节段放置于4%PFA溶液内进行后固定处理，4℃过夜。次日将脊髓组织取出，以脱髓鞘部位为中心将脊髓节段一分为二。头侧段脊髓放置于30%蔗糖溶液内继续固定，待其沉淀后行冷冻切片。尾侧段脊髓行常规石蜡包埋切片。石蜡切片常规制成5～6 μm层厚，冷冻切片制成20～30 μm层厚，采用防脱载玻片制片[6]。
1.3.3 染色方法
1.3.3.1 HE常规染色法 各组切片上脱蜡至水。二甲苯、无水乙醇浓度梯度染色，苏木精溶液和伊红溶液染色5～10 min，再用自来水冲洗，直至镜下见细胞核呈蓝色且更加清晰为止。80%乙醇稍作清洗，脱水透明封片。
1.3.3.2 LFB髓鞘染色 各组切片置于60℃电热箱内烘烤，取出后脱蜡至95%乙醇，置于0.1%LFB溶液中反应过夜。次日取出切片，放入95%乙醇、蒸馏水中清洗3次/5 min，再将切片相继放入0.05%碳酸锂溶液、70%乙醇分化，用蒸馏水清洗3次/5 min，脱水透明封片。
2 结果
2.1 HE染色切片的显示情况
模型组脱髓鞘大鼠脊髓内形态正常的神经元鲜有存留，治疗组脱髓鞘大鼠脊髓白质内的少突胶质细胞数量明显多于模型组的数量，且脊髓灰质区域内可见较多形态正常的神经元存在，却不及对照组数量。研究结果表明少突胶质细胞的移植治疗术后，少突胶质细胞在宿主脱髓鞘脊髓内髓鞘数量增多。
2.2 LFB髓鞘染色切片显示情况
模型组脱髓鞘大鼠脊髓病变较重，可见大小不等的片状脱髓鞘区，炎细胞浸润弥散，灰白质结构显著疏松、破坏严重，神经纤维走形紊乱，组织排列破坏且间隙大，形成的空洞也较多较大。相反，治疗组脱髓鞘大鼠脊髓组织的病变较模型组有所减轻，灰白质结构更加完整，组织排列间隙小、较紧密，灰白质内所形成的空洞更少、更小。
3 讨论
脊髓脱髓鞘疾病是一类病因或发病机制尚未彻底阐明的疾病 ......
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