RNA干扰致FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型的建立(2)

http://www.100md.com 2014年3月15日 于庆功 谷伟 王苏雅 张欣欣 杨子荣

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    参见附件。

     1.2.4 HT29细胞总RNA 抽提及RT-PCR 总RNA抽提按Trizol产品说明书进行。操作步骤如下：用PBS清洗两遍收集的细胞，RNA Trizol裂解，氯仿抽提，异丙醇、75%乙醇沉淀、洗涤后，溶解于DEPC水中，测定RNA浓度。利用提取的RNA进行RT-PCR，获得cDNA。RT-PCR按宝生物工程公司的试剂盒说明操作。RT条件为：42℃ 90 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。

    1.2.5 PCR 取cDNA作为模板扩增FRAT1和GAPDH，其中扩增FRAT1特异性引物为：sense primer：5′-GCCCTGTCTAAAGTGTATTTTCAG-3′，antisense primer：5′-CTCTGCAGTCCTACTCAAGCG-3′。扩增片段长325 bp。扩增GAPDH作为内参对照，引物序列分别是sense primer：5′-TCACCATCTTCCA GGAGCGAG-3′，antisense primer：5′-TGCTCAGTGTAGCCCAGGAT-3′。扩增产物长615 bp。PCR条件为：94℃ 3 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 25 s，72℃ 7 min，4℃ 5 min，30个循环。相关产物在琼脂糖凝胶上电泳鉴定。

    1.2.6 转染细胞总蛋白的提取及Western blot鉴定 收集细胞后用预冷PBS清洗两遍 ......

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