依达拉奉联合乌司他丁对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡的影响(2)
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参见附件。
1.2 模型制作及分组
将实验动物50只随机分为5组，假手术组(n=10)，丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水。其余4组参考赵秀梅等[4]的垫扎球囊法制作大鼠体心肌缺血/再灌注模型。将充盈的球囊(215 mm×10 mm)垫于冠状动脉前降支与结扎线之间，用力结扎，观察结扎区域变白，局部心肌运动减弱，两个以上导联上出现ST段明显上抬，提示结扎成功，45 min后将球囊快速抽空便可即刻实现前降支血流再灌注(以心电图相关导联ST段明显回落为标准)，并持续再灌注3 h。缺血/再灌注组(n=10)，结扎冠状动脉后5 min分别通过尾静脉接受静脉注射生理盐水，45 min后放松扎线使冠状动脉再通形成再灌注3 h至实验结束；缺血/再灌注+依达拉奉组(n=10)，结扎冠状动脉后5 min通过尾静脉接受静脉注射依达拉奉1.5 ml/(kg·h)，其余同缺血/再灌注组；缺血/再灌注+乌司他丁组(n=10)，结扎左冠状动脉左室支前30 min静脉注射乌司他丁(50 000 U/kg)，其余同缺血/再灌注组；缺血/再灌注+依达拉奉+乌司他丁组(n=10)，结扎左冠状动脉左室支前30 min静脉注射乌司他丁(50 000 U/kg)，结扎冠状动脉后5 min通过尾静脉接受静脉注射依达拉奉1.5 ml/(kg·h)，其余同缺血/再灌注组。实验结束后取大鼠左心室游离壁心肌组织迅速置液氮中冷却并于-80℃冻存。
1.3 GSH、MDA含量测定
实验结束后即刻分别取缺血区及正常供血区左心室心肌组织1.0 g，低温状态下生理盐水冲洗干净，制成心肌匀浆液，离心后取上清液，按GSH、MDA试剂盒说明书操作，检测GSH、MDA的含量。
1.4 细胞凋亡的检测(TUNEL法)
心脏标本用中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，制片，切片按试剂盒进行细胞凋亡检测。凋亡指数为计数1000个心肌细胞中染色阳性的凋亡细胞。
1.5 Western-blot法检测Caspase-3、Caspase-9蛋白水平
分别取5组心肌组织，提取总蛋白，收集上清液，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，TBST常温下封闭过夜后，分别加入anti-NF-κB小鼠单抗(一抗)、室温下免疫沉淀1 h ......
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