玻璃珠破碎法制备重组人CYP2C9酵母微粒体的条件优化(3)
1.2.4重组人CYP2C9酵母微粒体中蛋白含量的测定利用Lowry蛋白浓度测定试剂盒及分光光度计,测定不同浓度的BSA蛋白标准品的A650值,制备标准曲线。利用标准曲线计算所制备重组人CYP2C9酵母微粒体混悬液中的蛋白含量。操作步骤参照Lowry法蛋白浓度测定试剂盒说明书[17]。
1.2.5重组人CYP2C9酵母微粒体蛋白活性的测定
在模拟体内环境下,利用CYP2C9典型底物双氯芬酸的代谢反应,来验证所制备酵母微粒体的蛋白活性,并利用双氯芬酸经CYP2C9代谢的代谢物4-羟基双氯芬酸的生成量,来量化不同制备条件下所制备的微粒体蛋白活性。
酵母微粒体反应在48孔板中进行,每孔加入不同条件制备的重组人CYP2C9酵母微粒体356 μl及NADPH再生系统A液(NADP+ 26.1 mmol/L,6磷酸葡萄糖66.0 mmol/L,氯化镁66.0mmol/L)20 μl和B液(6磷酸葡萄糖脱氢酶40 U/ml)4 μl,预温孵10 min。加入20 μl底物双氯芬酸进行反应 ......
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