何菁荣 张 祎 代文秀 王月颖 傅思武

    西北民族大学医学部，甘肃兰州 730030

    艰难梭菌为革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，通常定植于人体肠道，是抗生素相关性腹泻的主要病原菌之一。当肠道微生态被破坏，艰难梭菌乘机大量繁殖产毒，导致艰难梭菌感染，其致病毒素以A 毒素(TcdA)和B 毒素(TcdB)为主，故目前艰难梭菌感染的预防及疫苗研究以TcdA、TcdB 为主要候选抗原[1-2]。面对国内外艰难梭菌感染的新特点和国内潜在爆发流行的趋势，积极研究基于艰难梭菌毒素A 疫苗并探索其最佳疫苗免疫途径，可以从根本上预防艰难梭菌感染的发生，有效阻止耐药菌株的扩散[3-4]。目前常用的免疫方式有腹腔注射、口服免疫、黏膜免疫[5-6]等，微针作为一种新型经皮免疫方式，通过在皮肤造出大量微细管道，使抗原活性成分快速渗入，有效地克服皮肤角质层屏障作用；不仅避免了口服给药带来的胃肠道副作用及肝脏的“首过效应”，且减弱了注射免疫的痛感及针刺恐惧症的限制，具有精准、快速，安全等特点[7-9]。本研究通过比较微针免疫与腹腔注射给药两种途径的免疫效果，探讨基于微针途径的艰难梭菌类毒素A 疫苗的黏膜免疫效应。

    1 对象与方法

    1.1 实验动物

    SPF 级BALB/c 小鼠，雌性18～22 g，6 周龄，购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，本研究已经西北民族大学实验动物伦理委员会审核通过。于室温22～26℃，湿度适宜，无菌环境喂养。

    1.2 主要仪器与试剂

    BHI 培养基(美国BBL 公司)；DEAE-Toyopearl 650M(日本东洋曹达株式会社)；三溴乙醇(SIGMA，T48402-25 g)；酶标仪(美国BIO-RAD680)；96 孔ELISA板、1 ml 无菌注射器、HRP-兔抗鼠(兰州生物制品研究所)；微针(YMR30，0.3 mm，540 Needle)；ABTS 底物、PBST 封闭液、甲醛、37℃培养箱(西北民族大学中心实验室)。

    1.3 实验分组及处理

    1.3.1 艰难梭菌类毒素A 疫苗制备 参考傅思武等[10]介绍的方法制备纯化艰难梭菌A 毒素后，加入终浓度0.4%的甲醛，放入37℃培养箱，脱毒10～14 d。细胞毒检测合格后，经透析，测定蛋白浓度，即得到艰难梭菌类毒素A 疫苗。

    1.3.2 疫苗免疫 适应喂养1 周后，将24 只BALB/c 小鼠采用随机数字表法将其分为对照组与观察组 ......