EtNBSe联合光动力疗法对成纤维细胞增殖及TGF-β1分泌的影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
1.2.4酶联免疫吸附法(ELISA)测定TGF-β1的含量消化处于对数生长期的细胞，以2×105个/孔的密度接种到24孔板中，每孔1 ml，每组设3个复孔，细胞长满80%~85%时，更换为含1%胎牛血清的高糖DMEM培养液，将细胞同步化处理24 h后，除空白孔，其余每孔加入梯度EtNBSe(0、60、120 pM)，预处理2 h后以红光进行照射，照射后更换培养基，48 h收集各组培养上清液，使用TGF-β1试剂盒，用双抗体夹心法测定细胞培养上清液中TGF-β1的含量，依次按说明书进行操作，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样本的浓度。
1.3统计学处理以SPSS 13.0统计软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，采取t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1梯度红光照射对成纤维细胞的影响为检测和摸索光动力疗法中，合适的红光照射时间，采用恒定波长的红光，梯度红光照射10~90 min，与对照组比较，细胞不产生明显的细胞增殖及细胞毒效应(P>0.05)。见图1。
图1梯度红光照射对细胞的影响
2.2梯度浓度EtNBSe联合红光光动力疗法对成纤维细胞的影响为检测和摸索实验中，合适的EtNBSe浓度，采用梯度EtNBSe处理组和梯度EtNBSe+红光照射组处理成纤维细胞，24 h后MTT法检测细胞功能。
图2EtNBSe处理不同时间后光对红胞的影响
与对照组比较，梯度EtNBSe处理组对细胞不产生明显的细胞毒反应及细胞增殖活性(P>0.05)。图2可见，梯度EtNBSe+红光照射组，在梯度EtNBSe处理1 h后照光，与对照组比较，对细胞不产生明显的细胞毒反应及细胞增殖(P>0.05)；在梯度EtNBSe处理2 h后照光，EtNBSe(30、60、120 pM)对成纤维细胞有增殖活性，以EtNBSe(60、120 pM)增殖活性最明显，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，当浓度继续增加时，EtNBSe(240 pM)增殖活性略有下降。
2.3EtNBSe-PDT对成纤维细胞TGF-β1分泌的影响为检测EtNBSe-PDT对成纤维细胞分泌TGF-β1的影响，将体外培养的成纤维细胞，分别按上一实验摸索的条件，给予EtNBSe(60、120 pM)联合红光照射处理，ELISA法检测上清中TGF-β1含量。
图3光动力疗法对TCF-β1分泌的影响
图3可见，EtNBSe(60、120 pM)处理联合红光照射后，可增加TGF-β1分泌。与对照组比较，EtNBSe(60、120 pM)+红光组，TGF-β1浓度分别增加28.57%和45.11%(P<0.05)。
3讨论
光动力疗法于二十世纪七十年代末问世，从治疗肿瘤开始，逐渐运用到皮肤美容外科治疗中。该疗法是近几年应用于嫩肤治疗的一项技术，借助光敏剂，经过特定波长的光照射后即发生光动力反应，生成单线态氧等，产生氧应激，而发挥其治疗效应，改善皮肤光老化的各种症状。
前期工作研究了单一IPL照射对体外成纤维细胞功能、分泌表型的影响，以及相关信号机制[3-4]。在此基础上，本实验继续探寻EtNBSe-PDT对细胞功能、分泌表型等方面的影响。
在本实验中，在单纯接收梯度剂量红光照射或梯度浓度EtNBSe处理后，未观察到成纤维细胞的增殖和细胞毒反应；而EtNBSe-PDT对原代培养的人包皮成纤维细胞具有双向调节作用，这种作用受光敏剂EtNBSe浓度和处理后间隔时间的影响，在梯度EtNBSe处理1 h后照光，对成纤维细胞无明显影响，可能是光敏剂处理时间太短，药物与细胞未充分结合，照光时，光源未能有效的穿透细胞；在梯度EtNBSe处理2 h后照光，随浓度增加，细胞先增殖后抑制，说明在EtNBSe-PDT组中，浓度和时间对皮肤成纤维细胞具有相互依赖关系，在合适的浓度和时间，对细胞有增殖的作用，当浓度继续增加，细胞内光敏剂积聚量越多，光照射时发生光反应越激烈，产生的光毒性越强。Akilov等[5]用光敏剂联合光动力疗法对利什曼寄生虫的疗效观察显示，控制PDT效率的参数不仅受分子的改变，单线态氧量子产率和分配系数的影响，还与光敏剂浓度和处理后间隔时间有一定关系。Ruiz等[6]在以往的基础上，改用MAL联合红光，对两侧面部使用不同敷药时间(分别为3 h和1 h)PDT的临床效果和副作用进行了对比分析，大部分患者敷药3 h的一侧，面部粗糙明显改善，且皮肤弹性增强。以上研究显示，EtNBSe-PDT可通过对EtNBSe浓度和处理时间的调控，提高成纤维细胞增殖活性，有可能进一步刺激新生胶原生长，从而改善皮肤光老化。
TGF-β1是转化生长因子-β超家族成员，它能刺激皮肤中成纤维细胞的增殖及胶原蛋白的合成，调控细胞增生、分化、凋亡、黏附、运动以及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)产生的细胞因子[7]。在皮肤光老化研究中，Fisher[8]，Quan等[9]发现，光老化皮肤自分泌TGF-β1减少、对TGF-β刺激的反应力减弱、细胞表面的TGF-β受体减少、配体-受体结合后磷酸化能力减弱，使细胞活性及I型前胶原合成减少。Bettinger 等[10]对成纤维细胞在瘢痕增生和组织纤维化的病理研究过程中表明，TGF-β1可以加速体外培养的成纤维细胞增殖和分裂，并同时促进Ⅰ型胶原的表达和蛋白合成。蔡泽浩等[11]通过特异性阻断TGF-β1信号传导，可明显抑制成纤维细胞的增殖活性，即说明TGF-β1是促成纤维细胞增殖因素之一。这些研究均表明TGF-β1分泌的增加可诱导皮肤成纤维细胞增殖活性的增强，从而促进胶原的合成，而光动力疗法的嫩肤机制也是促进胶原的合成。本实验从分泌表型上来看，EtNBSe-PDT可诱导成纤维细胞TGF-β1分泌的增加，在增殖活性(EtNBSe120 pM)最明显时，TGF-β1分泌量越多 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(3758kb)。