SOD及NF-κB在梗阻性黄疸大鼠肝脏损伤中的作用(2)
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参见附件。
1.3.1 SOD活力测定 肝组织块在冰生理盐水中漂洗、拭干，称重0.25 g剪碎。加入预冷的组织块重量9倍的生理盐水，手工匀浆上下转动研磨8 min，使组织匀浆化。低温低速离心机3000 g左右离心15 min，取上清液，按1：9比例用蒸馏水稀释，制备成l%的肝组织匀浆液。按照说明书操作方法进行测定。
1.3.2 肝脏组织切片HE染色及免疫组化染色 取10%福尔马林固定的肝脏组织，常规石蜡包埋、切片。HE染色切片观察记录肝脏组织的形态学变化，免疫组化染色抗NF-κB p65多克隆抗体一抗稀释浓度为1：200，采用SP三步法染色。
1.4 试剂与仪器 总胆红素及直接胆红素检测试剂盒购自浙江伊利康生物技术公司，NF-κBp65小鼠抗大鼠多克隆抗体购自Santa-cruz公司，兔抗小鼠二抗购自迈新生物公司，SOD测试盒购自南京建成生物研究所。总胆红素及直接胆红素检测采用Beckman LX-20全自动化生化分析仪。
1.5 统计学处理 使用PEMS 3.1软件进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 模型大体及肝脏组织切片HE染色病理改变观察 术后7 d及19 d，解剖大鼠见胆总管近肝侧呈囊状扩张，管内充满胆汁，肝脏呈黄褐色，弥漫性肿大，其中19 d组大鼠可见大量黄色腹水。肝脏组织常规HE病理切片光镜下见BDL 7 d组可见肝内胆管广泛扩张、肝细胞肿胀、大量空泡变性；汇管区有可见少量纤维组织及新生胆管增生。BDL 19 d组可见汇管区周围大片肝细胞变性、坏死，炎性细胞浸润，肝小叶较正常组织形态紊乱，且见小胆管、毛细血管以及纤维结缔组织增生向肝小叶内扩展。
2.2 血清生化检测结果 BDL 7 d组和19 d组血清TB、DB及ALT水平均明显高于sham组(P<0.01)，BDL 19 d组与BDL 7 d组比较，TB、DB及ALT有所下降(P<0.05或P<0.01)，但仍处于较高水平。见表1。
*与sham组比较，P<0.01；△P<0.05，#P<0.01，与BDL 7 d组比较
2.3 胆道梗阻大鼠肝脏中总SOD及CuZn-SOD活力检测结果 BDL7 d组和BDL 19 d组与Sham组比较显著减弱(P<0.01)，与BDL 7 d组相比，BDL 19 d组降低更加明显，两组酶活性比较差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。
*与sham组比较，P<0.01；△与BDL 7 d组比较，P<0.01
2.4 每张切片随机选取5个视野，在显微成像系统下(10×40倍)摄片，所有照片使用Image-Pro Plus图像处理软件计阳性表达的平均光密度。Sham组肝组织NF-κBp65蛋白未表达，或表达呈弱阳性，仅见少量细胞胞浆呈淡黄色，未见胞核着色。BDL 7 d组见胞浆中染色增强呈棕黄色，并可见胞核着色，与sham组相比差异有统计学意义(P<0.01)，19 d组较7 d组着色显著增强(P<0.01)，阳性细胞数增多。见表3。
*与sham组比较，P<0.01；△与BDL 7 d组比较，P<0.01
3 讨论
在正常的生理状态下，自由基的生成和清除处于稳态。氧自由基过量产生及脂质过氧化是器官损伤的最重要的机制之一[2]，而SOD是生物体防御过氧化损伤的关键酶类，主要功能是清除体内有氧代谢所产生的超氧自由基。梗阻性黄疸时，肝脏中总胆红素、胆汁酸、内毒素和TNF-α水平增高，使得体内产生大量超氧自由基，这是梗阻性黄疸脏器损伤的关键因素。SOD水平的高低决定了机体损害的程度。过去实验表明，梗阻性黄疸发生后SOD基因mRNA表达下调，且随梗阻时间延长其表达下调更为明显[3]。应用pLNCX-SOD基因转染肝细胞可增强对胆汁毒性的耐受。本实验分别测定了大鼠梗阻性黄疸7 d和19 d时肝脏组织中SOD的活力，与对照组相比总SOD及CuZn-SOD的活力显著降低，且随病变时间推移活力降低更加明显，进一步证实了胆道梗阻发生时肝脏中总SOD及CuZn-SOD活力显著降低，加之表达减少，使机体抗过氧化能力急剧下降，直接导致肝脏脂质过氧化损伤的发生。
在大多数细胞内，NF-κB以未活化状态存在且活性是可以被诱导的。未活化的NF-κB存在于细胞浆中，以其p65亚基与IκB结合，覆盖p50上的核定位信号，使静止细胞中NF-κB处于p50-p65-IκBβ多聚体的无活性状态，并被锚定在细胞质。当细胞受到细胞因子、LPS、氧自由基、双链RNA及紫外光等刺激时，可激活IκB激酶(IκK)使NF-κB从非活性的NF-κB-IκB复合物上解离下来，即被激活。激活的NF-κB进入细胞核，其亚基形成环状结构与DNA接触，参与基因的转录[4-5]。
过去的研究表明，NF-κB作为一种重要的炎症前基因的早期转录调控子，激活时可上调多种炎症因子如TNF-α、IL-1及IL-6等的表达水平[6]。本实验观测到，梗阻性黄疸发生时，观察组与对照组相比，肝脏中的NF-κB被显著地激活，出现核移位，这说明胆道梗阻时，体内产生大量的活性氧簇(ROI)。大量的活性氧成为转录因子NF-κB的激活剂。NF-κB激活后可以上调多种炎症因子的表达水平，尤其是TNF-α的过量表达。在近来研究发现，NF-κB除激发和促进炎症反应外，还具有促进肝细胞再生以及抗凋亡的作用[7-8]。NF-κB通过上调抗凋亡基因的表达而促进细胞的存活，可见NF-κB的作用似乎存在矛盾之处，其可能通过多种通路，发挥调控作用。如何明确其在分子调节中的地位和作用，如何精确调节NF-κB，趋利避害，有待于进一步深入研究。
参考文献
[1] Gong P， Wang Z Y， Wang H J. Protective effects of pLNCX-SOD gene transfection on hepatocyte injury induced by ohstructive jaundice in rats[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2007，6(2)：194-198.
[2] Brown K M， Brems J J， Moazzam F N， et al. The nitric oxide donor Molsidomine improves survival and reduces hepatocyte apoptosis in cholestasis and endotoxemia[J]. J Am Coll Surg，2003，197(2)：261-267.
[3] 巩鹏，王忠裕，赵作伟，等.梗阻性黄疸大鼠心肌TNF-α及SOD基因mRNA的表达[J] ......
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