放射线照射引起胶质瘤细胞细胞周期和凋亡的动力学变化及其对Chk1/2蛋白表达的影响(2)
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图3 Western blot法检测照射后Chk1/2蛋白表达
注：A：不同剂量射线照射24 h后Chk1、Chk2、Chk2-T68蛋白表达；B：10 Gy射线照射后Chk2-T68磷酸化水平随时间变化量
3 讨论
在长期进化过程中，机体形成了一套防止DNA发生损伤/错误的细胞周期监控机制，使机体遗传信息能够准确无误地传递到子细胞，这一套监控机制统称为DNA损伤检测点。在放疗条件下，DNA损伤检测点的激活，有利于肿瘤细胞DNA损伤/错误的修复，客观上为细胞的生存提供了条件，本质上是一种细胞的自我保护程序[2]。
本研究发现，U251细胞株在正常培养条件下主要处于G1/G0期，这与体外培养的其他哺乳动物细胞生长特性相似[3]。对胶质瘤U251细胞株进行射线照射处理后建立了U251细胞G2/M期的细胞周期阻滞模型，发现10 Gy射线照射24 h后引起非常显著的G2/M期阻滞，并在一定范围内呈现明显的时间依赖效应和剂量依赖效应。随着时间延长(24 h后)，阻滞于G2/M期的细胞开始释放，一部分细胞继续进入细胞周期，而另一部分细胞走向凋亡，表现为细胞凋亡明显增加。目前研究发现，照射所致的G2/M期阻滞比G1期阻滞更为普遍，大部分肿瘤细胞在接受照射后表现为G2/M期阻滞，而仅有p53(+)和Rb(+)表型的细胞接受照射后产生G1期阻滞，因为只有p53和Rb正常，且有p21参与时，细胞受到照射时才产生G1/S期阻滞，而大部分肿瘤细胞存在p53或Rb异常，因而丧失了G1/S期检测点的功能，仅保留了G2/M期检测点的功能，成为肿瘤细胞在损伤刺激下出现的自我保护机制的最后一道屏障[4]。
由于正常终末细胞的细胞周期基本处于停滞状态，大多数细胞均处于G1期，当其接受照射后依然表现周期停滞状态，无G2/M期阻滞表现，因此，封闭正常细胞的Chk1，Chk2其效果将较肿瘤细胞为差，因为Chkl和Chk2主要参与G2/M期阻滞，所以，封闭Chk1，Chk2本身就有肿瘤特异性，具有较强的靶向性，这将有利于扩大肿瘤治疗的治疗窗，提高治疗效果[5]。
研究还发现，U251细胞接受不同剂量的照射处理后，引起细胞周期阻滞的程度有一定的差异，在6 Gy的射线作用下，仅引起较轻微的G2/M期阻滞；在10 Gy射线作用24 h后，G2/M期阻滞达77.35%；当照射剂量增加至15 Gy时，则没有明显的细胞周期阻滞现象，而直接表现为凋亡的增加。这是因为当损伤较小或有望修复时，细胞通过一系列调节机制抑制细胞周期的进行，抑制DNA的复制，阻止细胞的分裂，为DNA修复系统提供充足的时间进行DNA修复，若修复成功，细胞继续进行或完成下一个细胞周期事件，若不能修复，细胞则发生凋亡[3]。同时，在观察U251细胞周期和凋亡的动力学变化中发现，细胞周期阻滞的程度在一定范围内表现为照射剂量依赖性增强，而细胞凋亡均发生于细胞周期阻滞解除后，其强度与细胞周期激活的程度成反比。
本研究发现，在接受不同剂量射线照射后U251细胞中Chk1和Chk2蛋白表达并不受影响，这与以往文献报道结果相一致[6]。Chk1和Chk2激酶主要在磷酸化激活后发挥作用，Chk1激酶第345位丝氨酸是其激酶激活的重要磷酸化位点[7]。本研究发现，射线照射后并不影响U251细胞中Chk1-S345的磷酸化，原因在于Chk1-S345主要由药物作用后被磷酸化，但Chk1激酶对照射后细胞周期检测的点功能维持也非常重要。照射后主要以Chk2激酶磷酸化激活为主，Chk2激酶第68位苏氨酸磷酸化在Chk2激酶激活中极为关键[8]，Chk2-T68被磷酸化后，继而引起Chk2自动磷酸化和激酶激活。照射后只影响Chk2-T68的磷酸化水平，不影响Chk1、Chk2蛋白水平的表达，磷酸化水平高低与照射剂量无明显关系。
参考文献
[1] Chou R C， Langan T J. In vitro synchronization of mammalian astrocytic cultures by serum deprivation[J]. Brain Res Brain Res Protoc，2003，11(3)：162-167.
[2] Shapiro G， Kaelin J W. Anticancer drug targets： cell cycle and checkpoint control[J]. J Clin Invest，1999，104(12)：1645.
[3] Schorl C， Sedivy J M. Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells[J]. Methods，2007，41(2)：143-150.
[4] Tang Y， Luo J， Zhang W， et al. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis[J] ......
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