超声辅助提取贯叶连翘总黄酮工艺研究(2)
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2.1.4 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml,分别置于25 ml容量瓶中,加水至10 ml,然后加入5% NaNO2溶液1 ml,摇匀,放置6 min;加10% Al(NO3)3溶液1 ml,摇匀,放置6 min;加4% NaOH溶液10 ml,再加水至刻度,摇匀,静置15 min,以芦丁浓度为0的溶液为空白对照,在510 nm波长处测定吸光度。以吸光度A对浓度C进行线性回归,得回归方程为A=13.2342 C+0.0026(r=0.9998),线性范围为0.01188~0.07128 mg/ml。
2.1.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液3.0 ml,照2.1.4项下标准曲线的操作,测定吸收度,重复6次,结果见表1,可见,本试验所采用的含量测定方法精密度可靠。
表1 精密度试验结果
序号 1 2 3 4 5 6
吸光度 0.472 0.469 0.472 0.473 0.475 0.469
RSD/% 0.50
2.1.6 重复性试验 精密吸取同一供试品溶液5份,每份3.0 ml,按2.1.4项下“分别置于25 ml容量瓶中”起依法操作,测定结果RSD为1.13%,表明该方法重现性良好。
2.1.7 加样回收率实验 精密吸取已知总黄酮含量的同一供试品溶液6份,每份3.0 ml,分别置于25 ml容量瓶中,精密加入对照品溶液适量,按2.1.4项下“加水至10 ml”起依法操作,测定其含量,计算回收率和RSD值。结果见表2,表明本试验所采用的含量测定方法准确度可靠。
表2 加样回收率试验结果
编号 样品含量(/mg) 加入量
(/mg) 测得量
(/mg) 回收率(/%) 平均回收率(%) RSD
(%)
1 1.452 0.581 2.034 100.2 99.1 0.68
2 1.452 0.581 2.023 98.3
3 1.452 0.726 2.169 98.8
4 1.452 0.726 2.171 99.0
5 1.452 0.872 2.313 98.7
6 1.452 0.872 2.320 99.5
2.1.8 样品的测定 精密吸取于试品溶液1.0 ml,置于25 ml容量瓶中,按2.1.4项下“加水至10 ml”起依法操作,测定吸光度,并根据吸光度-浓度回归方程计算提取物中总黄酮含量,然后按下式计算贯叶连翘总黄酮得率:贯叶连翘总黄酮得率(%)=[总黄酮含量(g)/原药材质量(g)]×100%
2.2 贯叶连翘总黄酮的提取 工艺流程:贯叶连翘药材→粉碎→超声提取→过滤→离心→减压浓缩→真空冷冻干燥→总黄酮提取物。称取贯叶连翘干燥粗粉50 g,按照表3均匀试验设计加入溶剂、设定超声提取的时间、温度和超声处理次数进行提取。提取完成后,纱布过滤(多次超声提取时,合并滤液),5000 r/min离心15 min,取上清液,减压浓缩,真空冷冻干燥,即得贯叶连翘总黄酮粗品。
2.3 均匀试验设计 根据预试验结果,选取乙醇浓度(X1)、提取温度(X2)、每次提取的乙醇用量(X3)、每次超声提取时间(X4)、超声提取次数(X5)等5个因素,采用DPS软件进行U10(104×5)混合水平均匀设计安排试验,因素水平及试验安排见表3。
2.4 回归分析 根据表3的提取试验结果,以贯叶连翘总黄酮得率为因变量,各因素为自变量,采用DPS软件对试验结果进行二次多项式逐步回归分析,得回归方程:Y=-1.88556+0.15688X1+0.02303X2+0.15113X3+0.01141X4-0.02038X5-0.001306X12-0.000214X22-0.000110X42+0.000133X52。对方程进行检验,该方程有显著统计学意义(r=0.9999,F=32499.91,P<0.01)。由于方程中各回归系数单位不一致,不能直接比较,对回归系数标准化。标准化回归系数见表4。
由表4可知,所选取的5个因素对贯叶连翘总黄酮的提取率都有直接影响,各因素影响强弱顺序:乙醇浓度(X1)>乙醇用量(X3)>提取时间(X4)>超声处理次数(X5)>提取温度(X2)。乙醇浓度、乙醇用量是决定浸出液浓度的主要因素,超声提取时间、处理次数和提取温度是次要因素。根据方程,结合生产实际,得最佳工艺:乙醇浓度60%,提取温度52 ℃,每次提取的乙醇用量20 ml/g,每次超声提取时间43 min,提取3次。
2.5 工艺验证 根据优化条件进行验证试验,制备3批样品,计算贯叶连翘总黄酮得率为6.52%(n=3)。结果与回归方程计算结果相近,认为所选工艺合理、可行。
3 讨论
应用超声辅助萃取法提取黄酮类天然药物,有助于提高提取率,减少提取时间,降低能耗,提高药材利用率[10],可以使资源紧张的贯叶连翘药材得到充分利用。均匀设计是基于试验点在整个试验范围内均匀散布的一种试验设计方法,在工艺优化、配方优化等方面有广泛的应用[11]。本研究通过均匀设计试验,对回归方程的综合分析,得出最佳提取工艺。验证试验表明,优化工艺条件较均匀设计表中其它工艺条件更为优越,说明采用均匀设计方法,不仅可以指导试验,还能进行中药有效成分提取工艺的建模和工艺条件优化,是选择最优条件的有力工具。 ......
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