牙周组织发育期上皮剩余的组织学观察
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【摘要】 目的：观察牙周组织形成过程中上皮剩余细胞的组织形态、细胞增殖凋亡。方法：TUNEL(TdT-mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL)法原位细胞凋亡检测牙周组织发育中上皮剩余细胞凋亡的情况。SP免疫组化法检测增殖核抗原(PCNA)和凋亡抑制基因Bcl-2、骨桥素(OPN)和骨涎蛋白(BSP)的表达。结果：牙周膜牙骨质侧可见上皮剩余(the epithelial rest of malassez)沿牙骨质表面成簇分布，根分叉和牙颈部较多，细胞数量不等，可见不规则核，簇内细胞相互重叠、排列无规则，TUNEL结果示上皮剩余中可找到凋亡阳性表达细胞。免疫组化可见上皮剩余细胞阳性表达OPN，但PCNA和BSP在此期上皮剩余细胞中为阴性表达。结论：在牙周发育过程中，伴随牙槽骨的改建和牙周膜纤维束走向的调整，上皮剩余经历塑形过程，细胞凋亡在这一过程中发挥重要作用。上皮剩余细胞的OPN阳性表达提示其在此过程中可能参与牙骨质的发育。
【关键词】 上皮剩余； 细胞凋亡； 牙周发育
上皮剩余是成熟牙周膜中唯一的上皮结构，上皮剩余的在牙周组织修复再生、内环境稳定等方面的可能作用已得更多研究人员的重视[1]，但目前对上皮剩余的研究仍比较匮乏，本文观察牙周组织发育期的上皮剩余细胞形态分布，研究该期上皮剩余细胞的增殖、凋亡及OPN和BSP的表达。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 原位细胞凋亡试剂盒(Roche German)；OPN和BSP多克隆抗体由Larry W.Fisher博士(National Institute of Dental and Craniofacial Research，Maryland，USA)馈赠；PCNA和Bcl-2单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、DAB显色剂(北京中杉)；Tris/HCI(Sigma USA)，蛋白酶K(MERK German)；OLYMPUS显微镜及照相系统(JAPAN)。
1.4 细胞凋亡检测采用原位末端标记(TdT-mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL)法，石蜡切片常规脱蜡水化至水，按照细胞凋亡原位检测试剂盒说明书操作，常规脱水封片，镜下观察照相。以PBS液代替TUNEL反应液作阴性对照。凋亡细胞阳性表达位于细胞核，为覆盖整个细胞核的棕黄色或褐色着色。
2 结果
2.1 HE染色 上皮剩余细胞靠近牙骨质表面呈簇状分布，主要分布于牙颈部和根分叉，簇内细胞数量不等，排列无规则，相互重叠，部分细胞界限不清，胞核不规则呈较强的嗜苏木精染色(图1)。
3 讨论
上皮根鞘(Hertwig’s epithelial root sheath)的诱导功能结束后，发生断裂，部分上皮细胞离开根面，迁入牙周膜，形成上皮剩余。牙周发育期牙槽骨改建活跃、牙周膜主纤维走向调整，上皮根鞘断裂后最终形成上皮剩余，所以上皮根鞘断裂后所经历的更新或塑形形成上皮剩余也是牙周组织正常发育的一部分。本研究结果表明，牙周组织发育过程中，上皮剩余细胞与牙周组织中的成骨细胞和成纤维细胞一样都可观察到细胞凋亡。成熟的牙周组织中的上皮剩余细胞在受到炎症等信号刺激后呈现增殖活性，可参与牙源性囊肿的发生[2]。牙周组织发育期上皮剩余细胞可发生细胞凋亡，但我们研究结果未发现此时上皮剩余细胞出现明显的增殖活性，提示其可能缺乏相关刺激因素，从而为表现明显增殖活性。有研究证实，伴随牙齿萌出，建合期在咬合力作用下上皮剩余表现出明显增殖的活性[3]。
细胞培养证实上皮剩余细胞可分泌前列腺素(prostaglan-
dins)和骨吸收因子(bone resorbing factor)，从而认为上皮剩余可能有抑制骨性结合，维持牙周膜间隙的作用[4]。Hasegawa等[5]发现在牙骨质修复中，上皮剩余细胞表现PCNA活性，其可能参与牙骨质的修复。OPN和BSP都是骨矿化相关因子，在骨质的形成和矿化中发挥重要作用，这些骨矿化相关蛋白可能在牙骨质的形成中发挥一定作用，有研究已证实OPN在牙骨质的形成发挥重要作用[6]。本研究结果证实，牙周发育期的上皮剩余细胞也表达OPN，与他们的实验结果相一致。上皮剩余并不是完全无用的剩余结构，在某些特定时期或刺激因素下可表现出积极的生物学性状，从而发挥某些生物学功能，不过其机制有待深入研究。
参考文献
[1] Haku K，Muramatsu T，Hara A，et al.Epithelial cell rests of Malassez modulate cell proliferation， differentiation and apoptosis via gap junctional communication under mechanical stretching in vitro[J].Bull Tokyo Dent Coll，2011，52(4)：173-182.
[2] Talic N F，Evans C A，Daniel J C，et al ......
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