甘露消毒丹及其挥发油对流感病毒感染小鼠肺部炎症相关因子的影响(2)
【Key words】 Influenza virus； Ganlu Xiaodu Micropill； Volatile oil； Cytokine
First-author’s address：Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.03.001
流行性感冒(流感)是一种常见的急性呼吸道传染病，由流感病毒(influenza virus，IV)感染引起，其发病率高，传染性强，人群普遍易感[1]。临床表现轻重不一，轻者仅表现为感冒，病程短、症状轻、预后良好，重者可发展为流感病毒性肺炎，甚则危及生命[2]。中医药在防治IV感染方面具有重要的作用，临床多以辛凉解表或清热解毒之品治之每获较好疗效。但近年由于雾霾等环境污染及人们生活方式的改变、饮食的偏嗜，体虚湿盛或湿热内蕴者日益增多，IV等病原微生物极易附着于PM2.5等微尘颗粒侵袭人体，并因人的体质而从化，发为湿热性质的病证。临床已有报道用甘露消毒丹(Ganlu Xiaodu Micropill，GXM)治疗IV感染取得了较好的疗效[3]。本研究从湿热蕴毒立论，探讨清热解毒、利湿化浊的GXM滴鼻、灌胃两种不同给药途径对IV感染小鼠肺部炎症的影响。通过观察小鼠肺组织病理炎症、肺指数、干湿比、肺组织超微结构、血清中IL-6、TNF-α含量变化及肺组织中NS1、NF-κB表达，揭示GXM一方两用对IV感染的效用机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒株 甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47(H1N1)，由辽宁中医药大学附属医院病毒室保存。
1.1.2 实验动物 SPF级BALB/c小鼠108只，体重(20±2)g，雌雄各半，购买于辽宁长生生物技术有限公司，生产合格证号：SCXK(辽)2013-009，使用合格证号：SYXK(辽)2015-0001。
1.1.3 药物及制备 GXM药物组成：滑石、黄芩、茵陈、石菖蒲、川贝母、木通、藿香、连翘、白蔻仁、薄荷、射干，中药饮片购于辽宁中医药大学附属医院门诊药局，经辽宁中医药大学中药分析教研室鉴定为正品。饮片以8倍量70%乙醇加热回流提取3次，1 h/次，合并每组3次提取的药液，回收溶剂并浓缩，制成含生药1 g/mL混悬液。挥发油制备：将中药粉碎，加8倍量水浸泡，装入冷凝器中，水蒸气蒸馏提取6 h，分层分取挥發油，制成含生药6 g/mL的药液。磷酸奥司他韦颗粒(生产厂家：宜昌长江药业，批准文号：国药准字H2009372)75 mg，配成1 mg/mL的溶液。每组药液均4 ℃保存备用。
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1.1.4 试剂与仪器 Trizol总RNA提取试剂，Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒、DEPC、DNAmarker DL2000，购于大连宝生物公司；小鼠IL-6、TNF-α ELISA试剂盒，Phospho-NF-κB p65抗体试剂盒，GAPDH，ECMII of Western-blot检测试剂盒浓缩型免IgG二抗，购于武汉博士德公司。
1.1.5 主要仪器 TP1020型自动组织脱水处理机；EG1150型石蜡包埋机(LEICA，德国)；RM2135型病理精密轮转切片机(LEICA，德国)；BX50F4型显微镜(OLY-MPUS)；荧光定量PCR仪(LC-Ⅱ)；IM71型酶标仪；PowerPac Universal电泳通用型电源；Trans-Blot SD半干转印系统(Bio-Rad，美国)；FlourChem Q蛋白印记成像系统(Proteinsimple，美国)；低温高速离心机(Heraeus，德国)；H-7650型透射电镜(日本株式会社)等。
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1.2 实验方法
1.2.1 动物分组 用随机数字表法将小鼠分为6组，分别为正常组(A组)、模型组(B组)、GXM灌胃组(C组)、GXM滴鼻组(D组)、GXM合用组(E组)、奥司他韦组(F组)，每组18只，对各组小鼠进行标记称重。
1.2.2 模型制备 实验动物适应性饲养1 d后，除A组动物外，其余动物在乙醚轻度麻醉下，经鼻腔接种甲型流感病毒FM1株(0.1 mL/只)。A组动物隔离饲养在同等条件下的房间，并按同样方法鼻腔接种生理盐水0.1 mL。
1.2.3 给药方法 C组、E组、F组于感染后24 h开始灌胃给药，0.3 mL/(d·次)，连续10 d；D组、E组于感染后24 h开始滴鼻给药，0.04 mL/(d·次)，连续10 d。A组、B组同步灌胃生理盐水0.3 mL。最后一次给药后禁水、禁食4 h。
1.2.4 标本采集 于造模后第3、7、10天采集标本，每组取6只，称重后摘眼球取血，储存于促凝管中，以4 000 r/min的速度离心5 min，取上层血清存于EP管中，-80 ℃冰箱冷藏以备ELISA检测。对小鼠进行颈椎脱臼处死，在无菌操作台将小鼠仰卧位固定，酒精消毒颈部及胸腹部，以无菌专用器械进行操作，打开胸腔，取出整个肺脏，称取肺重，计算肺指数(肺质量/体质量×100%)。取左肺放入4%多聚甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋、行HE染色，取右肺组织-80 ℃冻存，以备Western Blot、qPCR检测。根据文献[4]进行肺组织病理学评分。左肺下叶单独称重，置于37 ℃恒温箱中48 h后，再次称重，计算干湿比(干重/湿重)。第7天处死小鼠后迅速取其右肺上叶组织，2.5%戊二醛预固定，1%锇酸固定，环氧树脂浸透、包埋，切片，乙酸双氧铀、枸橼酸铅双层染色，置于透射电镜下观察肺组织超微结构的变化。
1.2.5 qPCR法NS1基因含量测定 引物根据文献[5]设计，NS1上游引物：5’-ATGGATCCAAACACTGTGTC-3’；下游引物：5’-TCAAACTTCTGACCTAATTGTTCC-3’；GAPDH，G1：5’-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3’，G2：5’CTCAGTGTAGCCCAGGATGC 3’，由北京六合华大基因合成。取肺组织制造细胞悬液，用Trizol提取细胞总RNA。分析RNA的纯度及完整性，检测RNA质量合格后，进行反转录，以反转录产物为模板，加入NS1的引物，进行qPCR检测。, 百拇医药(刘光华 贾晓 儒敏娜)
First-author’s address：Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.03.001
流行性感冒(流感)是一种常见的急性呼吸道传染病，由流感病毒(influenza virus，IV)感染引起，其发病率高，传染性强，人群普遍易感[1]。临床表现轻重不一，轻者仅表现为感冒，病程短、症状轻、预后良好，重者可发展为流感病毒性肺炎，甚则危及生命[2]。中医药在防治IV感染方面具有重要的作用，临床多以辛凉解表或清热解毒之品治之每获较好疗效。但近年由于雾霾等环境污染及人们生活方式的改变、饮食的偏嗜，体虚湿盛或湿热内蕴者日益增多，IV等病原微生物极易附着于PM2.5等微尘颗粒侵袭人体，并因人的体质而从化，发为湿热性质的病证。临床已有报道用甘露消毒丹(Ganlu Xiaodu Micropill，GXM)治疗IV感染取得了较好的疗效[3]。本研究从湿热蕴毒立论，探讨清热解毒、利湿化浊的GXM滴鼻、灌胃两种不同给药途径对IV感染小鼠肺部炎症的影响。通过观察小鼠肺组织病理炎症、肺指数、干湿比、肺组织超微结构、血清中IL-6、TNF-α含量变化及肺组织中NS1、NF-κB表达，揭示GXM一方两用对IV感染的效用机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒株 甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47(H1N1)，由辽宁中医药大学附属医院病毒室保存。
1.1.2 实验动物 SPF级BALB/c小鼠108只，体重(20±2)g，雌雄各半，购买于辽宁长生生物技术有限公司，生产合格证号：SCXK(辽)2013-009，使用合格证号：SYXK(辽)2015-0001。
1.1.3 药物及制备 GXM药物组成：滑石、黄芩、茵陈、石菖蒲、川贝母、木通、藿香、连翘、白蔻仁、薄荷、射干，中药饮片购于辽宁中医药大学附属医院门诊药局，经辽宁中医药大学中药分析教研室鉴定为正品。饮片以8倍量70%乙醇加热回流提取3次，1 h/次，合并每组3次提取的药液，回收溶剂并浓缩，制成含生药1 g/mL混悬液。挥发油制备：将中药粉碎，加8倍量水浸泡，装入冷凝器中，水蒸气蒸馏提取6 h，分层分取挥發油，制成含生药6 g/mL的药液。磷酸奥司他韦颗粒(生产厂家：宜昌长江药业，批准文号：国药准字H2009372)75 mg，配成1 mg/mL的溶液。每组药液均4 ℃保存备用。
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1.1.4 试剂与仪器 Trizol总RNA提取试剂，Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒、DEPC、DNAmarker DL2000，购于大连宝生物公司；小鼠IL-6、TNF-α ELISA试剂盒，Phospho-NF-κB p65抗体试剂盒，GAPDH，ECMII of Western-blot检测试剂盒浓缩型免IgG二抗，购于武汉博士德公司。
1.1.5 主要仪器 TP1020型自动组织脱水处理机；EG1150型石蜡包埋机(LEICA，德国)；RM2135型病理精密轮转切片机(LEICA，德国)；BX50F4型显微镜(OLY-MPUS)；荧光定量PCR仪(LC-Ⅱ)；IM71型酶标仪；PowerPac Universal电泳通用型电源；Trans-Blot SD半干转印系统(Bio-Rad，美国)；FlourChem Q蛋白印记成像系统(Proteinsimple，美国)；低温高速离心机(Heraeus，德国)；H-7650型透射电镜(日本株式会社)等。
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1.2 实验方法
1.2.1 动物分组 用随机数字表法将小鼠分为6组，分别为正常组(A组)、模型组(B组)、GXM灌胃组(C组)、GXM滴鼻组(D组)、GXM合用组(E组)、奥司他韦组(F组)，每组18只，对各组小鼠进行标记称重。
1.2.2 模型制备 实验动物适应性饲养1 d后，除A组动物外，其余动物在乙醚轻度麻醉下，经鼻腔接种甲型流感病毒FM1株(0.1 mL/只)。A组动物隔离饲养在同等条件下的房间，并按同样方法鼻腔接种生理盐水0.1 mL。
1.2.3 给药方法 C组、E组、F组于感染后24 h开始灌胃给药，0.3 mL/(d·次)，连续10 d；D组、E组于感染后24 h开始滴鼻给药，0.04 mL/(d·次)，连续10 d。A组、B组同步灌胃生理盐水0.3 mL。最后一次给药后禁水、禁食4 h。
1.2.4 标本采集 于造模后第3、7、10天采集标本，每组取6只，称重后摘眼球取血，储存于促凝管中，以4 000 r/min的速度离心5 min，取上层血清存于EP管中，-80 ℃冰箱冷藏以备ELISA检测。对小鼠进行颈椎脱臼处死，在无菌操作台将小鼠仰卧位固定，酒精消毒颈部及胸腹部，以无菌专用器械进行操作，打开胸腔，取出整个肺脏，称取肺重，计算肺指数(肺质量/体质量×100%)。取左肺放入4%多聚甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋、行HE染色，取右肺组织-80 ℃冻存，以备Western Blot、qPCR检测。根据文献[4]进行肺组织病理学评分。左肺下叶单独称重，置于37 ℃恒温箱中48 h后，再次称重，计算干湿比(干重/湿重)。第7天处死小鼠后迅速取其右肺上叶组织，2.5%戊二醛预固定，1%锇酸固定，环氧树脂浸透、包埋，切片，乙酸双氧铀、枸橼酸铅双层染色，置于透射电镜下观察肺组织超微结构的变化。
1.2.5 qPCR法NS1基因含量测定 引物根据文献[5]设计，NS1上游引物：5’-ATGGATCCAAACACTGTGTC-3’；下游引物：5’-TCAAACTTCTGACCTAATTGTTCC-3’；GAPDH，G1：5’-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3’，G2：5’CTCAGTGTAGCCCAGGATGC 3’，由北京六合华大基因合成。取肺组织制造细胞悬液，用Trizol提取细胞总RNA。分析RNA的纯度及完整性，检测RNA质量合格后，进行反转录，以反转录产物为模板，加入NS1的引物，进行qPCR检测。, 百拇医药(刘光华 贾晓 儒敏娜)