杨如镜 潘婷 林丽娜 黄晓帆 吴淑卿 王兴玲

    由卵巢肿瘤、性腺发育不全等导致的卵巢功能衰竭成为辅助生殖技术最大难题。2004年，Johnson等首次提出卵巢中存在生殖干细胞[1]，随后证实了出生后的小鼠卵巢中存在卵母细胞和卵泡的更新[2]。其他研究者也分别分离、培养了新生及成年小鼠，以及人的卵巢干细胞(Germline stem cells)[3-5]。这些发现为卵巢衰竭患者带来了新的希望。组织工程技术再生卵巢是利用卵巢来源的细胞、生物材料及组织工程技术构建人工卵巢，移植入体内，达到提高这些患者生活质量如内分泌激素分泌或最终生殖能力的改善等目的[6-7]。用于再生医学的生物材料有多种，笔者使用明胶海绵作为支架，种植标记来源于小鼠卵巢的细胞，初步探讨卵巢细胞移植后存活情况，观察明胶海绵体内降解情况，以期为今后构建人工卵巢提供参考，现报道如下。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验动物 使用8～12周SPF级KM雌鼠，购于汕头医学院实验动物中心，饲养在温度22～25 ℃，12 h 光照，12 h 黑暗的环境中。

    1.1.2 生物材料支架 可吸收Ⅰ型胶原海绵(typeⅠ absorbable collagen sponge，Integra Lifesciences，美国)。

    1.1.3 荧光标记物 CellTrackerTMCM-DiI(Invitrogen，美国)，储存液配制：用二甲基亚砜(DMSO)配制为2 mg/mL，分装后保存于-20 ℃，避免反复冻融。工作液配制：使用前用PBS配制，浓度为1 μM。

    1.1.4 消化酶 用不含血清的DMEM/F12配制终浓度为 3 mg/mLⅠ型胶原酶(typeⅠ collagenase，sigma，美国)及 4 mg/mL 中性蛋白酶(dispase，sigma，美国)，分装后-20 ℃备用，避免反复冻融。

    1.2 方法

    1.2.1 卵巢细胞分离 取6只雌鼠，脱颈椎处死，75%酒精消毒腹部皮肤后剪开皮肤及腹腔，找到输卵管及卵巢，在体视显微镜下分离出卵巢，尽量去除卵巢周围的脂肪及结蹄组织，换干净培养皿，用无菌眼科剪碎后加消化酶。37 ℃孵育30 min后，过70 μm细胞滤网(BD，美国)，离心，洗涤。

    1.2.2 细胞培养及荧光标记 分离的细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12(Gibco 低糖 ......