孔 刚， 吕学爱， 王丽雅， 胡迎春

    (山东省泰安市中心医院肾内科，泰安 271000)

    糖尿病肾病是糖尿病最主要的并发症之一，近年来，随着糖尿病患病人数的增多，糖尿病肾病发病率逐渐升高，并成为肾衰竭的主要原因[1]，危害患者生命安全。肾小管上皮细胞凋亡被认为是肾衰竭的主要原因，凋亡可影响高糖诱导肾小管损伤从而改变肾功能[2]。因此，缓解肾小管上皮细胞凋亡对于糖尿病肾病的防治具有重要意义。凝血酶敏感蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)作为一种与细胞凋亡、细胞黏附、血管生成等有关的多功能蛋白，在糖尿病肾组织中高表达，且与肾小管上皮细胞凋亡呈正相关[3]；转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)参与肾间质纤维化过程，通过诱导细胞凋亡参与肾脏纤维化[4]。研究[5]发现，TSP-1 可调控TGFβ1 从而影响血管生成，推测其也可能影响细胞凋亡。因此，本文通过感染TSP-1 shRNA 慢病毒，建立稳定敲低TSP-1 的HK-2 细胞系，探讨TSP-1 对高糖诱导HK-2 细胞凋亡的影响，为临床治疗糖尿病肾病提供一定理论依据。

    1 资料与方法

    1.1 细胞

    人肾小管上皮细胞HK-2 细胞系(中国科学院上海细胞库，产品编号：BNCC295660)。

    1.2 药物、试剂及仪器

    TSP-1 shRNA 慢病毒和对照慢病毒购自上海吉凯基因化学技术有限公司；引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；RNA 提取试剂盒、cDNA 合成试剂盒(Thermo Fisher 公司，货号分别为：12183018A、18091050)；CCK-8 试剂盒、Annexin V-FITC 试剂盒、兔抗TSP-1、TGF-β1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cystein-asparate protease 3，Caspase 3)、Caspase 9、B 淋巴细胞瘤-2 基因(B-cell lymphoma-2，BCL2)、Bcl-2 相关X 蛋白(Bcl-2 associated X protein，BAX)、β-actin 一抗、羊抗兔二抗(美国abcam 公司，货号分别为：ab228554、ab14085、ab263905、ab215715、ab13847、ab202068、ab182858、ab32503、ab179467、ab6721)；酶标仪、流式细胞仪(Thermo Fisher 公司，型号分别为：Varioskan LUX、Attune NxT)；实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction ......