质膜蛋白质组学技术的研究进展(2)
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2质膜蛋白的增溶
膜蛋白在经过成功的富集纯化后，由于含有疏水结构域而极易聚合而沉淀下来。最早常用反复冻融的方法促溶，但此法仅能溶解与整合蛋白疏松结合的肽段[18]。目前常用的方法是在裂解液中加入高溶度变性剂如SDS、CHAPS、胆汁酸盐及脱氧胆汁酸盐等，这些变性剂可断开蛋白质分子内部及蛋白质分子间的交联结构而广泛应用于膜蛋白的溶解中[19]。而变性剂的选择取决于之后拟选择的分析鉴定方法，这主要是由于某些变性剂的使用与之后的酶解或分离鉴定方法不兼容，而且很可能因此引入杂质信号而影响分析结果的精确性。当然，已有某些方法能够去除变性剂的干扰，如通过TCA沉淀蛋白而将变性剂去除等，但于此同时也会导致沉淀后的蛋白难以再溶而丢失，这就难以应用于低产量样品的纯化。近来，Rapi Gest SF等化学性表面活性剂逐渐应用于膜蛋白质样品的增溶。这种表面活性剂属于酸不稳定性阴离子型表面活性剂，在酸性条件下可被分解并通过离心去除，这一优势使其与随后的色谱和/或质谱分析高度相容。Donoghue等[20]结合Rapi Gest SF与变性剂的方法得到了3倍以上量的心肌膜蛋白。此外，某些有机修饰剂可作为添加剂促进蛋白酶的水解作用，如加入60%的乙醇或80%乙腈可促进疏水蛋白的裂解及裂解后肽段的溶解 [21,22]。
3质膜蛋白的分离分析方法
经典的IEF/2-D PAGE一度不适用于膜蛋白的分离，这主要是由于膜蛋白在各自的等电点时溶解度更低而倾向于沉淀下来。为了提高凝胶电泳对膜蛋白的分离能力，各种改进方法陆续被报道，Chick等[23]对比了不同范围IPG胶条对质膜蛋白质的分离效果，发现PI 3.4～4.9的窄范围IPG胶条可分离出2603个蛋白点，其中有826种蛋白质属于膜蛋白。而PI 3～10的宽范围IPG胶条可分离出的蛋白点仅为2021个，其中也仅有712种为膜蛋白。证实了窄范围IPG胶条的应用更加适合于分离分析质膜蛋白质 ......
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