载体介导RNA干扰技术在肿瘤治疗中的应用进展(1)
【摘要】由双链RNA(dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(PTGS)，称为RNA干扰(RNAi)。通过载体将外源性siRNA导入宿主细胞，以调节和关闭基因的表达，为肿瘤的治疗提供一条新的有效途径。本文就载体介导的RNAi在肿瘤治疗中的应用作一概述。
【关键词】载体；RNA干扰；肿瘤；治疗
Vector-mediated RNAi in cancer therapy research LIN Hong-tan, CAI Jian-chun.Teaching Hospital of Fujian Medical University,The First Affiliated Hospital of Xiamen University ,Xiamen 361003 ,China
【Abstract】RNA interference (RNAi) induced by double-strand RNA is a process of post-transcriptional gene silence. The exogenous siRNAs are led into the host cell by vector, and regulate gene expression on and off, which provide a new and effective way for cancer treatment.In this paper, vector-mediated RNAi in cancer therapy was reviewed.
, http://www.100md.com
【Key words】Vector；RNAi；Neoplasm；Treatment
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(dsRNA)介导的特异性降解相应序列mRNA致转录后水平基因沉默(post-tanscriptional gene silencing，PTGS)的现象[1]，RNAi最早在对植物的研究中发现[1]。2001年，Elbashir等[2]发现，在哺乳动物的细胞中也存在此现象，这促使了RNAi技术在疾病治疗研究中的应用研究。目前，人们已成功地构建了多种siRNA表达载体，然而如何使携带的外源性siRNA有效地进入动物细胞内还是一个难题。
1RNAi的载体类型
1.1RNAi非病毒性载体非病毒载体的基因治疗具有低免疫反应、安全稳定、低成本、适合工业生产等优点，使其成为体外基因转染的主要载体、质粒、纳米基因转运体、高分子载体等均为常用的siRNA载体，早期RNAi技术常采用体外化学合成双链siRNA，Elbashir等[2]运用阳离子脂质体携带化学合成的双链siRNA转染动物细胞。Dong等[3]运用球形聚乙丙烯凝胶作为新型载体通过静脉将质粒注射到肿瘤细胞中，延长了质粒在体内存留的时间，并且有效的阻止质粒被酶降解。其中，质粒是非病毒载体中较为常用、成熟且较为安全的一类?
, 百拇医药
1.1.1质粒的转染机制1900年，Wolff等[4]用质粒直接肌肉注射小鼠，并得到表达，从此，揭开了质粒载体用于基因治疗研究的序幕。质粒进入细胞后并表达大致包括以下步骤：被细胞识别后内吞进入胞质，定位到细胞核并且得到表达。在内吞过程中，质粒可能会进入内体(endosome)、溶酶体(lysosome)等，由于它们极低的pH环境和各种酶类都会使质粒部分降解。质粒进入细胞核后，其表达效率将直接取决于它所携带的基因表达系统。
1.1.2质粒常用的转染方法质粒常用的转染方法有：(1)机械方法。微注射可以把质粒DNA直接注射入细胞核，但是一次只能注射一个细胞，这限制了它在大规模的细胞转染和体内实验中的应用。(2)化学方法。在基因治疗中常用的介导试剂是脂质体(liposome)，它可分为阳离子(cationic)脂质体、阴离子(anionic)脂质体和pH敏感(pH sensitive)脂质体等。其中，阳离子脂质体是最为常用的脂质体，它由阳离子脂质和中性脂质按一定比例混合制成，它可以中和质粒表面的负电，减小质粒的体积，从而减少质粒和细胞膜的静电斥力，有利于质粒跨膜进入细胞。但是，有研究者认为脂质体在导入体内会产生一些毒素，影响siRNA的表达。新近推出了将脂质体和siRNA包裹在特殊的胶囊中，运输入体内后降低了脂质体的毒性，并能使siRNA稳定表达[5]。除了脂质体外，还有一起其它聚合物，凭借质粒DNA表面带负电这一特性，利用阳离子聚合物中和质粒的负电从而有利于质粒的跨膜。常用的阳离子聚合物有组蛋白、多聚左旋赖氨酸、多聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)等。多聚乙烯亚胺是一种分子量小、无毒性，且具有很高阳离子密度的聚合物，主要用于核酸的转染。Gao等[6]应用chitosan-linked-PEI实现高效、低毒将目的基因转入Hela等肿瘤细胞中，且有效的抑制了肿瘤细胞的生长。Koppu等[7]将质粒DNA和Polypropylenimine dendrimers混合物共同静脉注射到小鼠体内，提高了肿瘤的治疗效果。(3)此外，还有电穿孔法等，电穿孔法是在体外转染细胞时最为常用和最有效的方法之一。
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1.2RNAi病毒载体由于化学合成的双链siRNA极易诱发动物细胞产生干扰素，从而导致RNA的非特异性降解以及某些蛋白质合成受阻，而且存在一些诸如转染效率低、难以整合到宿主DNA及表达不稳定等缺陷。因此，在基因治疗中，病毒载体成为了最为有效的siRNA表达载体之一。
病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体等。病毒载体的转导效率较高，而且可以用于体内及体外的基因转导。慢病毒(lentivirus)是一种RNA病毒，属于逆转录病毒科(retrovidae)，它包括人免疫缺陷病毒(HIV)和猴免疫缺陷病毒(SIV)等[8]。研究证明，慢病毒载体能够在原代培养的造血干细胞和人巨噬细胞等哺乳动物各类细胞中实现稳定、有效的RNA干扰[9，10]。Tsai等[11]应用慢病毒介导的RNAi沉默CD4+、CD25+白血病的Foxp3基因发现，有效的降低了调节性T细胞样白血病肿瘤的生长，延长了肿瘤移植鼠的生存率。
2RNAi技术在肿瘤基因治疗中的应用
, 百拇医药
肿瘤是一种多基因、多因素的疾病。大多数肿瘤的发生都与基因的改变有关，主要表现在抑癌基因的失活、突变以及癌基因的扩增、过度表达等。Matsui等[12]发现RNAi技术对于外源性和内源性基因均有明显的作用。该技术由于能够高效、快速、特异性的抑制靶基因表达，使它被广泛应用于基因表达调控和功能基因组方面的研究，成为了研究肿瘤疗法的一项新工具。Tian等 [13]应用该技术分别在体内和体外沉默B细胞淋巴瘤的C-Rel蛋白的表达，实验结果证实了C-Rel-siRNA治疗的有效性，为B细胞淋巴瘤和自身免疫性疾病的小分子抑制治疗研究提供了一定的基础。
肿瘤的浸润、转移是患者死亡的主要原因。应用RNAi技术对肿瘤浸润、转移的发生机制及有关基因的改变进行研究，有助于加深理解恶性肿瘤的生物学本质。研究发现，MSP58基因作为一种进化上保守的核蛋白，在调节基因转录和恶性转化方面具有重要作用。Lin等[14]通过该技术靶定MSP58基因，研究其对U251胶质瘤细胞在体内的分化、转移、浸润、生长等方面影响，结果发现，MSP58下调后限制了胶质瘤细胞的生长，使肿瘤细胞在细胞生长周期停滞。该实验为MSP58基因作为胶质瘤治疗中新的候选靶定提供了生物学基础。, http://www.100md.com(林洪坦 蔡建春)
【关键词】载体；RNA干扰；肿瘤；治疗
Vector-mediated RNAi in cancer therapy research LIN Hong-tan, CAI Jian-chun.Teaching Hospital of Fujian Medical University,The First Affiliated Hospital of Xiamen University ,Xiamen 361003 ,China
【Abstract】RNA interference (RNAi) induced by double-strand RNA is a process of post-transcriptional gene silence. The exogenous siRNAs are led into the host cell by vector, and regulate gene expression on and off, which provide a new and effective way for cancer treatment.In this paper, vector-mediated RNAi in cancer therapy was reviewed.
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【Key words】Vector；RNAi；Neoplasm；Treatment
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(dsRNA)介导的特异性降解相应序列mRNA致转录后水平基因沉默(post-tanscriptional gene silencing，PTGS)的现象[1]，RNAi最早在对植物的研究中发现[1]。2001年，Elbashir等[2]发现，在哺乳动物的细胞中也存在此现象，这促使了RNAi技术在疾病治疗研究中的应用研究。目前，人们已成功地构建了多种siRNA表达载体，然而如何使携带的外源性siRNA有效地进入动物细胞内还是一个难题。
1RNAi的载体类型
1.1RNAi非病毒性载体非病毒载体的基因治疗具有低免疫反应、安全稳定、低成本、适合工业生产等优点，使其成为体外基因转染的主要载体、质粒、纳米基因转运体、高分子载体等均为常用的siRNA载体，早期RNAi技术常采用体外化学合成双链siRNA，Elbashir等[2]运用阳离子脂质体携带化学合成的双链siRNA转染动物细胞。Dong等[3]运用球形聚乙丙烯凝胶作为新型载体通过静脉将质粒注射到肿瘤细胞中，延长了质粒在体内存留的时间，并且有效的阻止质粒被酶降解。其中，质粒是非病毒载体中较为常用、成熟且较为安全的一类?
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1.1.1质粒的转染机制1900年，Wolff等[4]用质粒直接肌肉注射小鼠，并得到表达，从此，揭开了质粒载体用于基因治疗研究的序幕。质粒进入细胞后并表达大致包括以下步骤：被细胞识别后内吞进入胞质，定位到细胞核并且得到表达。在内吞过程中，质粒可能会进入内体(endosome)、溶酶体(lysosome)等，由于它们极低的pH环境和各种酶类都会使质粒部分降解。质粒进入细胞核后，其表达效率将直接取决于它所携带的基因表达系统。
1.1.2质粒常用的转染方法质粒常用的转染方法有：(1)机械方法。微注射可以把质粒DNA直接注射入细胞核，但是一次只能注射一个细胞，这限制了它在大规模的细胞转染和体内实验中的应用。(2)化学方法。在基因治疗中常用的介导试剂是脂质体(liposome)，它可分为阳离子(cationic)脂质体、阴离子(anionic)脂质体和pH敏感(pH sensitive)脂质体等。其中，阳离子脂质体是最为常用的脂质体，它由阳离子脂质和中性脂质按一定比例混合制成，它可以中和质粒表面的负电，减小质粒的体积，从而减少质粒和细胞膜的静电斥力，有利于质粒跨膜进入细胞。但是，有研究者认为脂质体在导入体内会产生一些毒素，影响siRNA的表达。新近推出了将脂质体和siRNA包裹在特殊的胶囊中，运输入体内后降低了脂质体的毒性，并能使siRNA稳定表达[5]。除了脂质体外，还有一起其它聚合物，凭借质粒DNA表面带负电这一特性，利用阳离子聚合物中和质粒的负电从而有利于质粒的跨膜。常用的阳离子聚合物有组蛋白、多聚左旋赖氨酸、多聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)等。多聚乙烯亚胺是一种分子量小、无毒性，且具有很高阳离子密度的聚合物，主要用于核酸的转染。Gao等[6]应用chitosan-linked-PEI实现高效、低毒将目的基因转入Hela等肿瘤细胞中，且有效的抑制了肿瘤细胞的生长。Koppu等[7]将质粒DNA和Polypropylenimine dendrimers混合物共同静脉注射到小鼠体内，提高了肿瘤的治疗效果。(3)此外，还有电穿孔法等，电穿孔法是在体外转染细胞时最为常用和最有效的方法之一。
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1.2RNAi病毒载体由于化学合成的双链siRNA极易诱发动物细胞产生干扰素，从而导致RNA的非特异性降解以及某些蛋白质合成受阻，而且存在一些诸如转染效率低、难以整合到宿主DNA及表达不稳定等缺陷。因此，在基因治疗中，病毒载体成为了最为有效的siRNA表达载体之一。
病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体等。病毒载体的转导效率较高，而且可以用于体内及体外的基因转导。慢病毒(lentivirus)是一种RNA病毒，属于逆转录病毒科(retrovidae)，它包括人免疫缺陷病毒(HIV)和猴免疫缺陷病毒(SIV)等[8]。研究证明，慢病毒载体能够在原代培养的造血干细胞和人巨噬细胞等哺乳动物各类细胞中实现稳定、有效的RNA干扰[9，10]。Tsai等[11]应用慢病毒介导的RNAi沉默CD4+、CD25+白血病的Foxp3基因发现，有效的降低了调节性T细胞样白血病肿瘤的生长，延长了肿瘤移植鼠的生存率。
2RNAi技术在肿瘤基因治疗中的应用
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肿瘤是一种多基因、多因素的疾病。大多数肿瘤的发生都与基因的改变有关，主要表现在抑癌基因的失活、突变以及癌基因的扩增、过度表达等。Matsui等[12]发现RNAi技术对于外源性和内源性基因均有明显的作用。该技术由于能够高效、快速、特异性的抑制靶基因表达，使它被广泛应用于基因表达调控和功能基因组方面的研究，成为了研究肿瘤疗法的一项新工具。Tian等 [13]应用该技术分别在体内和体外沉默B细胞淋巴瘤的C-Rel蛋白的表达，实验结果证实了C-Rel-siRNA治疗的有效性，为B细胞淋巴瘤和自身免疫性疾病的小分子抑制治疗研究提供了一定的基础。
肿瘤的浸润、转移是患者死亡的主要原因。应用RNAi技术对肿瘤浸润、转移的发生机制及有关基因的改变进行研究，有助于加深理解恶性肿瘤的生物学本质。研究发现，MSP58基因作为一种进化上保守的核蛋白，在调节基因转录和恶性转化方面具有重要作用。Lin等[14]通过该技术靶定MSP58基因，研究其对U251胶质瘤细胞在体内的分化、转移、浸润、生长等方面影响，结果发现，MSP58下调后限制了胶质瘤细胞的生长，使肿瘤细胞在细胞生长周期停滞。该实验为MSP58基因作为胶质瘤治疗中新的候选靶定提供了生物学基础。, http://www.100md.com(林洪坦 蔡建春)