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编号:13758846
树突状细胞酸敏感离子通道蛋白基因表达研究(1)
http://www.100md.com 2011年12月15日 杨琴 严笑 谭政
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    参见附件。

     【摘要】目的检测DC细胞上是否有酸敏感离子通道(ASICs)基因表达,为之后DC细胞与ASICs关系及酸性微环境影响DC细胞功能的分子路径等研究奠定基础。方法提取DC2.4细胞的总RNA并逆转录为cDNA,以小鼠海马组织作为阳性对照,GAPDH作为内参,用针对ASIC1保守序列的引物(含限制性内切酶的酶切位点)进行PCR检测,选取ASIC1相应条带,用DpnⅠ酶切,连接到T19载体上,转染至DH5ɑ细菌中,在含有氨苄青霉素的培养基中扩增,小量提取单克隆菌群的质粒,再次用DpnⅠ酶切,将酶切产物与DC2.4细胞的PCR产物分别电泳,选择有与DC2.4细胞相同条带的菌群进行测序,并利用BLAST对测序结果与NCBI中搜索的ASIC序列进行比对。结果RT-PCR检测发现DC2.4存在与ASIC1对应mRNA相同长度的条带;测序结果证实其为ASIC1对应的mRNA序列。结论DC2.4细胞上有ASIC1对应mRNA的表达,ASIC1可能在酸性微环境影响DC细胞功能的途径中发挥作用。

    【关键词】树突状细胞;酸敏感离子通道;酸性微环境

    Expression of acid-sensing ion channels gene on dendritic cells YANG Qin,YAN Xiao,TAN Zheng.Tongji Medical College of Huazhong University of Science & Technology,Wuhan 430000,China

    【Abstract】ObjectiveTo detect whether the ASIC genes express on the DC cells, to lay the foundation for the study such as the relationship between DC cells and ASICs,the molecular pathways of the acidic microenvironment affecting DC cells function.MethodsExtracting the reverse transcript the total RNA of DC2.4 cells to cDNA.PCR and electrophoresis using primers of the Conservative ASIC1 sequence,while mouse hippocampus as a positive control,GAPDH as a reference.Selecting the corresponding strip of ASIC1.Cuting the PCR product via Dpn Ⅰ Enzyme,connect them to the T19 vector,and transfect to DH5α bacteria,which is trained in the medium containing ampicillin.Then extracted a little of plasmid from a monoclonal flora, cut with Dpn Ⅰ Enzyme again,and Electrophoresis.Selecting the flora with the same bands with the ones of DC2.4 cells,sequencing and comparing with the sequencing result from NCBI via BLAST.ResultsRT-PCR of DC2.4 cell detected a band of similar length with the corresponding mRNA of ASIC1;And it was confirmed by the results of sequencing. ConclusionThere is the corresponding mRNA of ASIC1 expression on DC2.4 cells.It is probable that ASIC1 produce a marked effect in the pathway which the acidic micro-environment affects DC cells.

    【Key words】Dendritic cells (DC);Acid-sensing ion channels (ASICs);Acidic micro-environment

    树突状细胞(Dendritic cell,DC)因其形态具有树突样或伪足样突起而命名,是目前所知的机体免疫系统中功能最强的一种专职的抗原呈递细胞(APC)[1],能有效激活初始型T细胞,在免疫应答的启动、调控上起着关键的作用。体内大部分DC处于非成熟状态,DC细胞摄取、处理及呈递抗原,发挥其功能的过程也就是它分化、迁移、成熟的过程[2],多种不同的刺激可激发DC细胞从不成熟的抗原捕获细胞到成熟的抗原呈递细胞的转化,也就间接地影响到免疫应答的启动。

    研究表明,酸性微环境(pH值6.5)能显著刺激DC细胞摄取FITC-OVA、FITC-dextran和HRP,而在pH值7.3的环境中,要使DC细胞达到与在pH值6.5环境中同样的胞饮作用,细胞外抗原浓度须达到后者10倍以上的浓度。此外,酸性环境还能上调CD11c、MHCⅡ分子、CD40、CD86的表达和DC细胞呈递抗原的能力[3,4]。

    酸敏感离子通道(ASICs)是一类可以直接被组织酸化(即质子,H+)激活的离子通道,有4种亚型,广泛分布于全身各组织,参与从学习记忆到细胞损伤等多种生理和病理过程[5]。现已发现,ASICs在缺血缺氧性损伤和炎症等与酸中毒相关的多种病理生理过程中发挥着重要的作用[6]。由此推测,酸性微环境可通过ASICs促进DC细胞的成熟和功能的发挥,从而影响机体的免疫应答。

    然而,目前还未发现有DC细胞与ASICs相关的研究,本实验旨在检测DC细胞上是否有ASICs基因表达,以期为DC细胞与ASICs之间的关系及酸性微环境影响DC细胞功能的分子路径等研究奠定基础。

    1材料与方法

    1.1材料与仪器

    1.1.1细菌菌株、细胞系DC2.4细胞系、DH5α细菌和T19载体为本实验室保存。

    1.1.2引物引物由本实验室用Primer 5.0和Oligo软件设计,上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

    1.1.3试剂Trizol试剂购自北京华舜;PCR Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffe、T4DNA连接酶、Dpn Ⅰ限制性内切酶购自Takara公司;DL2000 marker购自上海博道;DMSO、DEPC购自Amresco公司;逆转录试剂盒购自Fermentas公司;1640培养基购自Gibco2BRL公司;胎牛血清(FBS) 购自HyClone公司;微量质粒提取试剂盒购自U2gene公司;其他试剂为国产分析纯。

    

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