实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响因素
【摘要】 目的：探讨实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的效果，对影响因素进行分析总结。方法：选择2010年1月-2012年1月笔者所在医院收治的300例乙肝病毒感染患者，收集其血标本，通过实时荧光定量PCR检测方法进行乙肝DNA检验，对检验结果与临床诊断结果进行对比分析，对影响检验结果的因素进行分析总结。结果：本组300例乙肝感染患者血标本中，采用实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测结果与临床诊断结果相同276例(92.0%)，漏诊误诊24例(8.0%)，主要的影响因素包括实验室因素、标本因素和核酸提取方法因素等。结论：采用实时荧光定量PCR对乙肝DNA进行检测，具有较高的确诊率，但对检测结果产生影响的因素较多，需要加强注意，才能降低漏诊和误诊率，为治疗提供有效支持。
【关键词】 实时荧光定量PCR； 乙肝DNA； 影响因素
中图分类号 R446.1 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2014)5-0063-02
乙肝病毒是最为常见的感染性疾病病毒，是肝硬化、慢性肝炎和原发性肝细胞癌等疾病的主要病毒，其中乙型病毒性肝炎是一种以肝脏炎性病变为主的多器官损伤综合疾病，是当前我国传播范围最广，危害最大的一种传染病[1]。当前，实时荧光定量PCR检测技术是进行乙肝DNA检测最为有效的方法之一，应用逐渐加强。本文选取笔者所在医院收治的300例乙肝病毒感染患者进行研究，对实时荧光定量PCR检测的效果和影响因素进行了分析，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2010年1月-2012年1月笔者所在医院收治的300例乙型肝炎病毒感染患者，其中男157例，女143例，年龄10～65岁，平均32.5岁。
1.2 检测方法
对本组300例患者进行血标本制作，在空腹时抽取静脉血，注入干燥消毒的试管内，且试管内含有EDTA-K2抗凝管；使用离心机离心5 min；使用实时荧光定量PCR进行乙肝DNA的检测；首先在94 ℃下进行2 min的预变性，随后进行40个55 ℃～95 ℃循环，模板DNA经加热至95 ℃左右一定时间后，使模板DNA双链DNA解离成为单链后，温度降至55 ℃左右，引物与模板DNA单链配对结合；反应结束后，制作标本曲线，计算标本中的DNA模板量；依据试剂盒内的阳性质控标准进行标本的定量阳性质控；进行核酸扩增。本组研究中所采用的药剂和器械均统一，试剂盒为厦门安普利生物工程有限公司生产，仪器为9800型PCR扩增仪。以综合临床诊断结果为标准，对实时荧光定量PCR对乙肝DNA的检测结果准确率进行对比，并对导致两者差异的因素进行分析总结。
1.3 统计学方法
所得数据采用SPSS 13.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验，计数资料采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
本组300例乙肝病毒感染患者，采用实时荧光定量PCR进行乙肝DNA检测，与临床综合诊断结果进行对比，确诊276例(92.0%)，漏诊误诊24例(8.0%)，实时荧光定量PCR检测与临床诊断比较差异无统计学意义(P>0.05)。对影响检测结果的因素进行分析，主要包括实验室条件、血标本操作和核酸提取操作等影响因素。
3 讨论
3.1 实验室条件影响因素
PCR技术操作对实验室的条件要求较高，轻微的污染都会导致其产生假阳性的检测结果。实验室硬件要求为：试剂储藏的准备区、标本制备区、扩增反应混合物配置区和扩增分析区；软件要求为：人员专业培训、技术验收和规范化管理等[2-5]。本组研究中，有3例漏诊误诊病例是由于实验室条件因素影响所致，占12.5%，需要进一步加强实验室硬件建设和软件管理。
3.2 标本因素影响
标本因素影响，包括标本抗凝血因素、存储因素、溶血和血脂因素等[6-7]。标本抗凝血因素：使用肝素抗凝素时，会导致标本血液的裂解失效，使得实时荧光定量PCR不能分别对血浆和血清进行有效检测；标本存储因素：静止时间过长，超过3 h，或存储温度高于25 ℃等，均会导致标本变性，对检测结果产生影响；溶血及血脂因素：溶血和血脂会导致标本内血红蛋白变形，部分酶失去活性从而导致荧光信息强度变化，对检测结果产生影响[8-10]。
3.3 核酸提取方法因素
不同的核酸提取方法会对实时荧光定量PCR检测的结果产生不同的影响，其中磁珠核酸提取法的准确度较高，煮沸裂解核酸提取法的准确度较低，本次试验全部采用磁珠提取法，但操作差异导致检验结果异常[11-12]。
综上所述，实验室条件、标本抗凝血、标本存储、溶血和血脂以及核酸提取方法等是对实时荧光定量PCR检测乙肝DNA结果产生影响的主要因素，需要采取的措施有：提高实验室硬件设置水平、严格实验室操作和管理；严格选择试剂盒，采用专业冰箱，将拆封试剂和未拆封试剂分开保存，标本采集严防污染，一人一个吸头，对标本进行详细信息的登记；采用准确度较高的磁珠提取法进行核酸提取；对仪器设备加强管理，严格规范操作标准，定期消毒、保养和校准，保证精度等。对实时荧光定量PCR检测乙肝DNA的影响因素进行了解和预防，可以进一步提高检测的准确度，减少漏诊和误诊。
参考文献
[1]翁厚光，曹维克，张迎梅，等.肝功能异常的乙肝患者血清中自身抗体检测分析[J].山东医药，2012，52(7)：67-68.
[2]林森，易荣.实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响因素[J].国际检验医学杂志，2012，33(1)：127-128.
[3]魏颖.实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响因素[J].求医问药：学术版，2012，10(12)：373.
[4]付蕾.HBV-DNA荧光定量PCR检测的临床意义[J].检验医学与临床，2010，7(10)：960-961.
[5]王蔚青，王彤，孟玲，等.实时定量PCR法测定乙肝病毒脱氧核糖核酸[J].药学与临床研究，2010，18(2)：149-151，155.
[6]刘兵，胡蓉，杨联云，等.乙型肝炎病毒DNA定量分析的临床意义[J].中国医药导刊，2012，14(4)：673-674.
[7]俞安清，陈效琴，苏丽萍，等.实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义[J].中国临床实用医学，2010，4(1)：88-89.
[8]叶儒军，魏威.乙肝病毒DNA与乙肝病毒标志物的相关性研究[J].国际检验医学杂志，2012，33(23)：2932-2933.
[9]张海业，孙溯荫，韦兰，等.乙肝血清标志物模式与HBV-DNA含量的关系探讨[J].国际医药卫生导报，2011，17(10)：1229-1232.
[10]孔令和，商素香，柯云霞，等.POE产物直接测序检测乙型肝炎病毒耐药变异位点[J].南方医科大学学报，2012，3(2)：277-279.
[11]张庆安.乙肝患者血清免疫学标志物检测结果与HBV-NA定性、定量关系的分析[J].山东医药，2012，5(11)：74-76.
[12]石艳艳，罗红权，朱巧英，等.孕妇血清乙肝病毒载量与血清学免疫标志物的关系[J].实用医学杂志，2012，28(16)：2745-2747.
(收稿日期：2013-10-12) (编辑：韩珊珊), 百拇医药(赖新华 吕娜 彭艳辉)
【关键词】 实时荧光定量PCR； 乙肝DNA； 影响因素
中图分类号 R446.1 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2014)5-0063-02
乙肝病毒是最为常见的感染性疾病病毒，是肝硬化、慢性肝炎和原发性肝细胞癌等疾病的主要病毒，其中乙型病毒性肝炎是一种以肝脏炎性病变为主的多器官损伤综合疾病，是当前我国传播范围最广，危害最大的一种传染病[1]。当前，实时荧光定量PCR检测技术是进行乙肝DNA检测最为有效的方法之一，应用逐渐加强。本文选取笔者所在医院收治的300例乙肝病毒感染患者进行研究，对实时荧光定量PCR检测的效果和影响因素进行了分析，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2010年1月-2012年1月笔者所在医院收治的300例乙型肝炎病毒感染患者，其中男157例，女143例，年龄10～65岁，平均32.5岁。
1.2 检测方法
对本组300例患者进行血标本制作，在空腹时抽取静脉血，注入干燥消毒的试管内，且试管内含有EDTA-K2抗凝管；使用离心机离心5 min；使用实时荧光定量PCR进行乙肝DNA的检测；首先在94 ℃下进行2 min的预变性，随后进行40个55 ℃～95 ℃循环，模板DNA经加热至95 ℃左右一定时间后，使模板DNA双链DNA解离成为单链后，温度降至55 ℃左右，引物与模板DNA单链配对结合；反应结束后，制作标本曲线，计算标本中的DNA模板量；依据试剂盒内的阳性质控标准进行标本的定量阳性质控；进行核酸扩增。本组研究中所采用的药剂和器械均统一，试剂盒为厦门安普利生物工程有限公司生产，仪器为9800型PCR扩增仪。以综合临床诊断结果为标准，对实时荧光定量PCR对乙肝DNA的检测结果准确率进行对比，并对导致两者差异的因素进行分析总结。
1.3 统计学方法
所得数据采用SPSS 13.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验，计数资料采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
本组300例乙肝病毒感染患者，采用实时荧光定量PCR进行乙肝DNA检测，与临床综合诊断结果进行对比，确诊276例(92.0%)，漏诊误诊24例(8.0%)，实时荧光定量PCR检测与临床诊断比较差异无统计学意义(P>0.05)。对影响检测结果的因素进行分析，主要包括实验室条件、血标本操作和核酸提取操作等影响因素。
3 讨论
3.1 实验室条件影响因素
PCR技术操作对实验室的条件要求较高，轻微的污染都会导致其产生假阳性的检测结果。实验室硬件要求为：试剂储藏的准备区、标本制备区、扩增反应混合物配置区和扩增分析区；软件要求为：人员专业培训、技术验收和规范化管理等[2-5]。本组研究中，有3例漏诊误诊病例是由于实验室条件因素影响所致，占12.5%，需要进一步加强实验室硬件建设和软件管理。
3.2 标本因素影响
标本因素影响，包括标本抗凝血因素、存储因素、溶血和血脂因素等[6-7]。标本抗凝血因素：使用肝素抗凝素时，会导致标本血液的裂解失效，使得实时荧光定量PCR不能分别对血浆和血清进行有效检测；标本存储因素：静止时间过长，超过3 h，或存储温度高于25 ℃等，均会导致标本变性，对检测结果产生影响；溶血及血脂因素：溶血和血脂会导致标本内血红蛋白变形，部分酶失去活性从而导致荧光信息强度变化，对检测结果产生影响[8-10]。
3.3 核酸提取方法因素
不同的核酸提取方法会对实时荧光定量PCR检测的结果产生不同的影响，其中磁珠核酸提取法的准确度较高，煮沸裂解核酸提取法的准确度较低，本次试验全部采用磁珠提取法，但操作差异导致检验结果异常[11-12]。
综上所述，实验室条件、标本抗凝血、标本存储、溶血和血脂以及核酸提取方法等是对实时荧光定量PCR检测乙肝DNA结果产生影响的主要因素，需要采取的措施有：提高实验室硬件设置水平、严格实验室操作和管理；严格选择试剂盒，采用专业冰箱，将拆封试剂和未拆封试剂分开保存，标本采集严防污染，一人一个吸头，对标本进行详细信息的登记；采用准确度较高的磁珠提取法进行核酸提取；对仪器设备加强管理，严格规范操作标准，定期消毒、保养和校准，保证精度等。对实时荧光定量PCR检测乙肝DNA的影响因素进行了解和预防，可以进一步提高检测的准确度，减少漏诊和误诊。
参考文献
[1]翁厚光，曹维克，张迎梅，等.肝功能异常的乙肝患者血清中自身抗体检测分析[J].山东医药，2012，52(7)：67-68.
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[4]付蕾.HBV-DNA荧光定量PCR检测的临床意义[J].检验医学与临床，2010，7(10)：960-961.
[5]王蔚青，王彤，孟玲，等.实时定量PCR法测定乙肝病毒脱氧核糖核酸[J].药学与临床研究，2010，18(2)：149-151，155.
[6]刘兵，胡蓉，杨联云，等.乙型肝炎病毒DNA定量分析的临床意义[J].中国医药导刊，2012，14(4)：673-674.
[7]俞安清，陈效琴，苏丽萍，等.实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义[J].中国临床实用医学，2010，4(1)：88-89.
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[10]孔令和，商素香，柯云霞，等.POE产物直接测序检测乙型肝炎病毒耐药变异位点[J].南方医科大学学报，2012，3(2)：277-279.
[11]张庆安.乙肝患者血清免疫学标志物检测结果与HBV-NA定性、定量关系的分析[J].山东医药，2012，5(11)：74-76.
[12]石艳艳，罗红权，朱巧英，等.孕妇血清乙肝病毒载量与血清学免疫标志物的关系[J].实用医学杂志，2012，28(16)：2745-2747.
(收稿日期：2013-10-12) (编辑：韩珊珊), 百拇医药(赖新华 吕娜 彭艳辉)