水痘带状疱疹病毒流行的主要基因型
【摘要】 目的：探讨分析水痘带状疱疹病毒流行的主要基因型。方法：选取笔者所在医院2013年4月-2015年4月收集的88例水痘带状孢疹病毒标本，采用冻融、煮沸的方式提取标本中的DNA，分别检测VZV、IgM抗体，多重PCR扩增水痘带状疱疹病毒ORF22、38、54并测序。分析核酸序列可采用和Primer premier 5软件酶切位点和用Clustal W软件。结果：经多重RCP检测结果得知，水痘带状疱疹毒患者皮损标本阳性率为84.09%(74/88)，同时和与Dumas序加以对比后得知，在37902、38055、38081、38177时74份阳性桥本ORF22会存有在点突变，和符合基因型J型特点相符。ORF54和ORF38分别位于PstI和Bglt酶切位点。结论：本文所研究的88例水痘带状孢疹病毒标本的主要基因型成J型、ORF54及ORF38。
【关键词】 水痘； 带状疱疹病毒； 基因型
中图分类号 R511.5 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2015)25-0143-02
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2015.25.069
水痘会经潜伏再感染后形成带状疱疹病毒，该病毒基因组相对保守，病毒株间的差异小于0.2%，分别在整个基因组的点突变会构成水痘带状疱疹病毒的基因型基础。水痘带状疱疹病毒的基因型主要有M、E和J，研究分析其基因型有利于为水痘防控工作提供依据[1]。对此，本文则选取部分标本为研究对象观察其主要基因型，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取笔者所在医院2013年4月-2015年4月收集的88例水痘带状孢疹病毒标本，其标本均为水痘患者，平均病程4.7 d。74例阳性患者中，54例带状孢疹，其中男31例，女23例，年龄4～40岁。20例为水痘患者，其中男33例，女22例，年龄3～81岁。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 大肠埃希菌JM109感受态细胞、DNA提取试剂盒、质粒pMD 19-T、TaqTM试剂盒(日本TaKaRa公司)；ELISA 试剂盒(德国维润(塞润)试剂公司)、2%琼脂糖凝胶(美国Promega公司)、PCR纯化试剂盒(美国Qiagen 公司)[2]。
1.2.2 临床标本收集 先用无菌0.9%氯化钠溶液对患者水疱、脓疱或浆痂等皮损处清洁2次，之后用无菌棉签轻轻擦拭疱液及其基底部。最后签在盛有1 ml 0.9%氯化钠溶液的离心管中充分将无菌棉签充分搅拌后。混悬液在-20 ℃条件下保存。
1.2.3 DNA提取 在混悬液标本5 min中放入10 000 r/min离心，舍弃上清液后；加入100μl DNA提取液涡旋混匀。在100 ℃孵育10 min后放入-20 ℃状态下冷冻1 h；10 000 r/min离心5 min，收集上清液。
1.2.4 PCR检测 (1)引物：根据相关文献针对水痘带状孢疹病毒ORF22、38、54的合成引物(北京奥科公司)。其中ORF22扩增产物为447 bp，上游引物为：5’-GGGTITITI'GTATGAGCGTTGG-3’，下游引物为：5’-CCCCCGAGGTI'CGTAATATC-3’。ORF38扩增产物为350 bp，上游引物为：5’-TTGAACAATCACGAACCGTT-3’，下游引物为：5’-CGGGTGAACCGTATTCTGAG-3’ORF54：扩增产物为222 bp，上游引物为：5’-GGAACCCCTGCACCATI’’AAA-3’，下游引物为：5’-TCCCTI"CATGCCCGTI’ACAT-3’。(2)PCR扩增反应体系和条件：在50 dl反应体系中依次加入10×反应缓冲液(含MgCI2：20 mmol/L)5.0μl，2.5 mmol/L dNTP 4.0 dl，上下游引物各0.2 dl(100μmol/L)，DNA样品6μl，Taq酶0～3μl(1.5 U)，去离子水34.3μl。在多重PCR时，同时加入3对引物，上下游引物各0.2μl，去离子水33.5μl，其他条件不变。PCR产物均经3%琼脂糖凝胶电泳。
1.2.5 序列测定与基因型判定 按照常规方法连接回收产物与质粒pMD 19-T 载体，同时采用PCR 纯化试剂盒回收聚合酶反应产物，之后转入大肠埃希菌JM109感受态细胞。初步鉴定菌落和筛选蓝白斑。如果所检测克隆菌株为阳性，则立即送往北京相关技术工作进一步测序，在GenBank 中用Blastn比较分析测序结果。相关研究文献支出，在37837～38283位点之间，水痘带状疱疹毒有6个位点可准确的将该病毒分为4个基因型，即E、J、M1 和M2，而这6个位点为37902、38005、38019、38177、38081、38229；在6个位点中中E 基因型的中E基因型代表株为Dumas株，其基因型依从为AGTAGA，J和M2因型依次为GGCCAA和AGTCGA，M2在分型时也根据6个位点的不同类型碱基。
2 结果
经多重RCP检测结果得知，水痘带状疱疹毒患者皮损标本阳性率为84.09%(74/88)，同时和与Dumas序加以对比后得知，在37902、38055、38081、38177时74份阳性桥本ORF22会存有在点突变，和符合基因型J型特点相符。ORF54和ORF38分别位于PstI和Bglt酶切位点。具体结果如图1和图2所示。
3 讨论
水痘有较强的传染性，是儿童期常见病之一，而水痘带状疱疹属于疱疹病，属于HHV-3型，它是引发水痘的主要感染源，由它引起的水痘的发生率会遍及世界范围内，尤其在免疫力低下的儿童中流行性最强。由于实验室缺乏水痘带状疱疹病原学治疗，所以至今水痘仍未纳入我国规定的传染病管理之中，其基因型的研究自然而然处于空白状态。VZV基因型稳定基因型变异的两个主要来源可能是点突变和基因重组，随着水痘减毒活疫苗在预防医学中的应用，追踪疫苗对野生型VZV基因型流行的影响可通过了解VZV流行的基因型，同时也有利于区分疫苗接种不良事件[3-4]。建立在对VZV基因组ORF22进行基因序列分析基础之上的VZV基因分型结果与多个ORF点突变分型结果一致，能够区分J、E、M这3个主要的基因型。本文研究结果显示，经多重RCP检测结果得知，水痘带状疱疹毒患者皮损标本阳性率为(74/88)，同时和与Dumas序加以对比后得知，在37902、38055、38081、38177时74份阳性桥本ORF22会存有在点突变，和符合基因型J型特点相符。ORF54和ORF38分别位于PstI和Bglt酶切位点，由此可推测，地理、族群、气候明是VZV基因型的主要因素，VZV基因型以M型都分布在北纬30°与南纬30°之间的地区，E基因型都分布在北纬30°以上与南纬30°以下地区，水痘带状疱疹基因型以J型则分布在北纬31°附近的长江中下游地区。
综上所述，本文所研究的88例水痘带状孢疹病毒标本的主要基因型成J型、ORF54及ORF38。
参考文献
[1]刘兰，杜宝中，张勇仓，等.西藏地区水痘-带状疱疹病毒临床分离株基因型研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2012，32(11)：934-938.
[2]王艳，马艳，韩悦，等.辽宁省水痘-带状疱疹病毒基因型分析[J].中国公共卫生，2012，28(1)：76-78.
[3]陈婷婷，王合，王晓慧，等.福建地区水痘-带状疱疹病毒临床分离株基因型分析[J].中华微生物学和免疫学杂志，2012，32(7)：614-616.
[4]马瑞，许国章，李翔，等.宁波市水痘-带状疱疹病毒流行株基因分型[J].中国公共卫生，2012，28(5)：659-660.
(收稿日期：2015-05-16) (编辑：程旭然), 百拇医药(彭彦茜 赵文健 陈福春 何汉江 罗峰 黄秀珍 杨志英)
【关键词】 水痘； 带状疱疹病毒； 基因型
中图分类号 R511.5 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2015)25-0143-02
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2015.25.069
水痘会经潜伏再感染后形成带状疱疹病毒，该病毒基因组相对保守，病毒株间的差异小于0.2%，分别在整个基因组的点突变会构成水痘带状疱疹病毒的基因型基础。水痘带状疱疹病毒的基因型主要有M、E和J，研究分析其基因型有利于为水痘防控工作提供依据[1]。对此，本文则选取部分标本为研究对象观察其主要基因型，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取笔者所在医院2013年4月-2015年4月收集的88例水痘带状孢疹病毒标本，其标本均为水痘患者，平均病程4.7 d。74例阳性患者中，54例带状孢疹，其中男31例，女23例，年龄4～40岁。20例为水痘患者，其中男33例，女22例，年龄3～81岁。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 大肠埃希菌JM109感受态细胞、DNA提取试剂盒、质粒pMD 19-T、TaqTM试剂盒(日本TaKaRa公司)；ELISA 试剂盒(德国维润(塞润)试剂公司)、2%琼脂糖凝胶(美国Promega公司)、PCR纯化试剂盒(美国Qiagen 公司)[2]。
1.2.2 临床标本收集 先用无菌0.9%氯化钠溶液对患者水疱、脓疱或浆痂等皮损处清洁2次，之后用无菌棉签轻轻擦拭疱液及其基底部。最后签在盛有1 ml 0.9%氯化钠溶液的离心管中充分将无菌棉签充分搅拌后。混悬液在-20 ℃条件下保存。
1.2.3 DNA提取 在混悬液标本5 min中放入10 000 r/min离心，舍弃上清液后；加入100μl DNA提取液涡旋混匀。在100 ℃孵育10 min后放入-20 ℃状态下冷冻1 h；10 000 r/min离心5 min，收集上清液。
1.2.4 PCR检测 (1)引物：根据相关文献针对水痘带状孢疹病毒ORF22、38、54的合成引物(北京奥科公司)。其中ORF22扩增产物为447 bp，上游引物为：5’-GGGTITITI'GTATGAGCGTTGG-3’，下游引物为：5’-CCCCCGAGGTI'CGTAATATC-3’。ORF38扩增产物为350 bp，上游引物为：5’-TTGAACAATCACGAACCGTT-3’，下游引物为：5’-CGGGTGAACCGTATTCTGAG-3’ORF54：扩增产物为222 bp，上游引物为：5’-GGAACCCCTGCACCATI’’AAA-3’，下游引物为：5’-TCCCTI"CATGCCCGTI’ACAT-3’。(2)PCR扩增反应体系和条件：在50 dl反应体系中依次加入10×反应缓冲液(含MgCI2：20 mmol/L)5.0μl，2.5 mmol/L dNTP 4.0 dl，上下游引物各0.2 dl(100μmol/L)，DNA样品6μl，Taq酶0～3μl(1.5 U)，去离子水34.3μl。在多重PCR时，同时加入3对引物，上下游引物各0.2μl，去离子水33.5μl，其他条件不变。PCR产物均经3%琼脂糖凝胶电泳。
1.2.5 序列测定与基因型判定 按照常规方法连接回收产物与质粒pMD 19-T 载体，同时采用PCR 纯化试剂盒回收聚合酶反应产物，之后转入大肠埃希菌JM109感受态细胞。初步鉴定菌落和筛选蓝白斑。如果所检测克隆菌株为阳性，则立即送往北京相关技术工作进一步测序，在GenBank 中用Blastn比较分析测序结果。相关研究文献支出，在37837～38283位点之间，水痘带状疱疹毒有6个位点可准确的将该病毒分为4个基因型，即E、J、M1 和M2，而这6个位点为37902、38005、38019、38177、38081、38229；在6个位点中中E 基因型的中E基因型代表株为Dumas株，其基因型依从为AGTAGA，J和M2因型依次为GGCCAA和AGTCGA，M2在分型时也根据6个位点的不同类型碱基。
2 结果
经多重RCP检测结果得知，水痘带状疱疹毒患者皮损标本阳性率为84.09%(74/88)，同时和与Dumas序加以对比后得知，在37902、38055、38081、38177时74份阳性桥本ORF22会存有在点突变，和符合基因型J型特点相符。ORF54和ORF38分别位于PstI和Bglt酶切位点。具体结果如图1和图2所示。
3 讨论
水痘有较强的传染性，是儿童期常见病之一，而水痘带状疱疹属于疱疹病，属于HHV-3型，它是引发水痘的主要感染源，由它引起的水痘的发生率会遍及世界范围内，尤其在免疫力低下的儿童中流行性最强。由于实验室缺乏水痘带状疱疹病原学治疗，所以至今水痘仍未纳入我国规定的传染病管理之中，其基因型的研究自然而然处于空白状态。VZV基因型稳定基因型变异的两个主要来源可能是点突变和基因重组，随着水痘减毒活疫苗在预防医学中的应用，追踪疫苗对野生型VZV基因型流行的影响可通过了解VZV流行的基因型，同时也有利于区分疫苗接种不良事件[3-4]。建立在对VZV基因组ORF22进行基因序列分析基础之上的VZV基因分型结果与多个ORF点突变分型结果一致，能够区分J、E、M这3个主要的基因型。本文研究结果显示，经多重RCP检测结果得知，水痘带状疱疹毒患者皮损标本阳性率为(74/88)，同时和与Dumas序加以对比后得知，在37902、38055、38081、38177时74份阳性桥本ORF22会存有在点突变，和符合基因型J型特点相符。ORF54和ORF38分别位于PstI和Bglt酶切位点，由此可推测，地理、族群、气候明是VZV基因型的主要因素，VZV基因型以M型都分布在北纬30°与南纬30°之间的地区，E基因型都分布在北纬30°以上与南纬30°以下地区，水痘带状疱疹基因型以J型则分布在北纬31°附近的长江中下游地区。
综上所述，本文所研究的88例水痘带状孢疹病毒标本的主要基因型成J型、ORF54及ORF38。
参考文献
[1]刘兰，杜宝中，张勇仓，等.西藏地区水痘-带状疱疹病毒临床分离株基因型研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2012，32(11)：934-938.
[2]王艳，马艳，韩悦，等.辽宁省水痘-带状疱疹病毒基因型分析[J].中国公共卫生，2012，28(1)：76-78.
[3]陈婷婷，王合，王晓慧，等.福建地区水痘-带状疱疹病毒临床分离株基因型分析[J].中华微生物学和免疫学杂志，2012，32(7)：614-616.
[4]马瑞，许国章，李翔，等.宁波市水痘-带状疱疹病毒流行株基因分型[J].中国公共卫生，2012，28(5)：659-660.
(收稿日期：2015-05-16) (编辑：程旭然), 百拇医药(彭彦茜 赵文健 陈福春 何汉江 罗峰 黄秀珍 杨志英)
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