瑞香狼毒对麦冬黑斑病菌的活性成分研究
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【摘要】以麦冬黑斑病菌为供试菌,采用生物活性跟踪法、 生长速率测定法和系统溶剂提取法对瑞香狼毒根中的抑菌活性物质进行了提取和分离。研究结果表明, 抑菌活性物质主要集中在95%乙醇提取物中。利用柱层析和抑菌活性跟踪的方法从95%乙醇提取物中分离出一个高抑菌活性物质D333，用二倍稀释法测得该活性成分对稻瘟病原菌得MIC为11.2ug/mL。
【关键词】瑞香狼毒; 黑斑病菌; 抑菌活性成分。
瑞香狼毒主治水肿腹胀，痰、食、心腹疼痛、咳喘、瘰疬、痰核、疥癣、灭蝇蛆[2]，民间将狼毒广泛用于抗肿瘤，抗结核及皮肤病的治疗，取得了较好的效果。有报道瑞香狼毒对蔬菜水果病菌均有不同程度的抑菌效果[3]，但到目前为止，对中药材的杀菌活性没有报道。
瑞香狼毒本身就是一种中药材，作为中药材的杀菌剂来于大自然又去于大自然，无残留不破坏生态环境，更不影响中药材原材料的质量，为中药材原材料的质量提供了很好的保证。本文以麦冬的黑斑病菌为供试菌，对瑞香狼毒的抑菌活性成分进行了研究，为今后以中药材来作为杀菌剂提供了参考依据。
1、材料和方法
1.1材料
瑞香狼毒根 买自四川若尔盖。将买回的瑞香狼毒根粉碎过40目筛，装入塑料袋密封后贮存于冰箱备用。
供试菌 采于校内未施药药用植物园内
供试仪器 旋转蒸发仪、水浴搅拌器、标准试剂(分析纯)、层析硅胶板、层析柱、恒温培养箱、游标卡尺、紫外灯、烘箱
1.2方法
1.2.1浸提法
称取1000g瑞香狼毒干粉，加入适量溶剂，室温密封的容器中冷浸24小时，50度水浴搅拌12小时后抽滤，滤液减压浓缩至最少体积。如此重复3次，合并3次提取物分别得到石油醚提取物(A 表示)、无水乙醇提取物(B表示)和甲醇提取物(C表示)并分别测抑菌活性。
1.2.2去鞣质[1]
在上述抑菌活性较高的B提取物中加入乙醇溶解(控制pH4.5)，使含醇量达80%-90%，加入3%明胶至沉淀完全，过滤，回收乙醇得提取物(D表示)，并测抑菌活性。
1.2.3 硅胶柱层析[1]
取D样品适量，用少量正己烷溶解,干法装大柱，洗脱剂为正己烷、乙酸乙酯、丙酮配成一系列极性逐渐增强的组分，梯度洗脱，洗脱剂流速为5滴/s，边收集流分边薄层层析检测，合并主成分相同的流分。流分在薄层板上展开，用紫外灯、浓硫酸和碘粉显色检测，同时做好显色标记。浓缩相同流分得到样品D1、D2、D3，同时做抑菌活性。将活性高的样品D3继续柱层析，直到分离到单体化合物。
1.2.4抑菌活性测定方法[4]
样品用培养基梯度稀释制成含药平板，取菌碟放入制备好的冷却凝固的药平板中央，以不加药的培养基作为对照CK，置于28℃培养箱中培养7d。测量菌落直径，计算菌丝抑制率。
菌丝生长抑制率(%)＝对照菌落生长直径一处理菌落生长直径×100
对照菌落生长直径
1.2.4 二倍稀释法测MIC[6]
适宜菌液准备：将每支装有4.5ml水的8支试管放入灭菌锅灭菌，在无菌室将事先摇好的黑斑病菌液取0.5ml加入第一支试管中得到第一个浓度10-1，然后从第一支试管中取出0.5ml加入到第二支试管中得到浓度10-2，依次类推得到浓度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。上述每个浓度取2ml分别与30ml无菌培养基混匀，倒平板，每个浓度倒2个平板，27度培养观察7天，选30-300个菌落单个平板为宜，本实验取 10-7 浓度。
提取物的准备：试管架上放入分别装有1支4ml和8支2ml丙酮的灭菌试管，称取提取物0.2g加入第一支4ml丙酮的试管中，得到第一个浓度稀释20倍，然后从第一支试管中取出2ml加入第二支试管中得到第二个浓度稀释40倍，依次类推得到稀释浓度(20、40、80、160、320、640、1280)倍和CK。
将上面稀释好浓度的试管和CK中分别加入0.1ml10-7菌液，摇匀后放入恒温箱27度培养，待CK变浑浊，开始转平板，每个浓度和CK吸0.1ml转入平板，用推棒推均匀，再将平板放入恒温箱27度培养，当CK开始长满菌落为标准，平板菌落个数小于10个的最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)。提取物每个浓度做3个重复，算平均值。
2、结果与分析
2.1石油醚提取物对黑斑病菌的生物活性测定结果
试验中，以7天周期观察对菌丝生长抑制率作为生物活性指标，来评价提取物对黑斑病菌生物活性的强弱。从表1可以看出石油醚提取物对黑斑病菌具有一定抑制作用，当浓度为5mg/ml时抑菌率为21.6%。
2.2无水乙醇提取物对黑斑病菌的抑菌活性测定结果
从表2可以看出，瑞香狼毒无水乙醇提取物对麦冬黑斑病菌具有抑菌活性，当提取物浓度为0.3125mg/ml时显示有微弱的抑菌活性，当浓度为5mg/ml时，对菌丝的抑制率可以达37.9，并且随着浓度的升高抑菌活性明显增大。
2.3 甲醇提取物对黑斑病菌的抑菌活性测定结果
从表3可以看出甲醇提取物对黑斑病菌具有一定的抑菌活性。当浓度为5mg/ml时，对菌丝的抑制率可以达29.6%。
2.4 去鞣质后样品对黑斑病菌的抑菌活性
从表4看出B样品去鞣质后得到的D样品，相同浓度抑菌活性升高约10个百分点。
2.2 D样品过大柱各流分对黑斑病菌的抑菌活性
从表5可以看出大柱三流分D3抑菌活性最强，当浓度为5mg/ml时抑菌率达到68.9%，D1抑菌活性最弱，当浓度为5mg/ml浓度为20%，D1、D2、D3三种流分抑菌活性依次增强，因此将D3作为下一步过中柱的起始样品。
2.3 D3样品过中柱各流分对黑斑病菌的抑菌活性
从表6可以看出中柱三流分D32抑菌活性最强，当浓度为5mg/ml时抑菌率达到79.5%，而D31和D32抑菌活性都低于中间流分，抑菌活性比较D32> D31> D33，因此将D32作为下一步过小柱的起始样品。
2.4 D32样品过小柱各流分对黑斑病菌的抑菌活性
从表7可以看出小柱细分到一个高抑菌成分D333， 该成分浓度为5mg/ml时抑菌率高达90.2%， 当浓度低为0.15625mg/ml时抑菌率仍达30 ......
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