HPLC法测定清肝颗粒中小檗碱的含量
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摘要：目的 建立测定清肝颗粒中盐酸小檗碱含量的高效液相色谱法。方法 以Kromasil C18柱(5μm，4.6mm×250mm)为色谱柱，流动相为乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液-磷酸(40:60:0.2)，流速为1.0mL/min ，检测波长为350nm。结果 盐酸小檗碱线性范围为0.04125～0.660μg，r=0.9999；平均回收率为99.21% ，RSD 为1.18%。结论 该方法可靠，灵敏，快速，适合测定清肝颗粒中盐酸小檗碱的含量。
关键词 清肝颗粒 盐酸小檗碱 HPLC
Determination of Berberine Hydrochloride in Qinggan Granule by HPLC.Liu Chun-di,Liu Xiao-yan,Yu hui.The ZhangJiagang’s hospital of TCM,ZhangJia gang 215600,Jiang Su,China.
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【Abstact】Objective To establish HPLC method for the determination of berberine hydrochloride in Qinggan Granule.Mehod The KromasilCl8(4.6mmX 250mm，5μm)was usedwith acetonitrile— 0.05mol·L～ Potassium dihydrogen phosphate solution—phosphoric acid(40：60:0.2)as a mobile phase.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The detecting wavelength was350nm .Results The linear of berberine hydrochloride was in the range of 0.04125~0.660g，r=0.9999.The average recovery was 99.21% and RSD was 1.18%.Conclusion Themethod was reliable， sensitive，rapidand suitable for the quality control of berberine hydrochloride in Qinggan Granule.
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【Key Words】 Qinggan Granule；berberine hydrochloride； HPLC
肠易激综合症(Irritable bowel syndrome，IBS)是一种十分常见的慢性、非器质性胃肠功能紊乱症状， 临床以腹痛及大便性状改变为主要表现[1]。该症普通人群患病率较高，清肝颗粒即针对该症，方中以黄连为君药，现代研究表明黄连药效物质基础为黄连生物碱，包括小檗碱(berberine)，黄连碱(coptisine)，甲基黄连碱(worenine)，掌叶防己碱(palmatine)等。其中小檗碱含量最高，小檗碱是中药黄连(Coptis chinensis Franch)中的主要生物碱和药效成分[2]，含量约为7%~9% [3] ，具有抗菌、抗炎、抗血栓、抗溃疡、降血糖等药理作用[4]，故选择小檗碱为含量测定指标，我们参考现行版中国药典一部“左金胶囊”项下小檗碱含量测定方法，采用HPLC法测定本制剂中小檗碱的含量，方法可靠、灵敏、快速。
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1 仪器及试药
1.1 仪器 Waters 515泵，Waters 2487紫外-可见检测器，Rheodyne 进样器，中科院大连化学物理所WDL-95色谱工作站。
1.2 试药 盐酸小檗碱(中国药品生物制品检定所，批号：10713-200208，供含量测定用)；乙腈为高效液相色谱纯(美国默克公司生产)，磷酸(AR)、磷酸二氢钾(AR)，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：反相C18柱：Kromasil C18柱(5μm，4.6mm×250mm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液-磷酸(40:60:0.2)；检测器灵敏度：0.5AUFS。流速：1.0mL/min。测定波长：350nm。
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2.2 溶液制备
2.2. 1 对照品溶液 精密称取小檗碱对照品1.32mg，加甲醇定容至10ml，配成0.132mg/ml的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液[5] ① 提取溶媒的考察：精密称取清肝颗粒约0.5g，分别加1%盐酸甲醇、甲醇、80%甲醇、70%乙醇超声处理，加甲醇至刻度，摇匀，取3mL离心(10000r/分) 10分钟，取上清液按上述色谱条件分析，结果表明1%盐酸甲醇提取率最高，故选择1%盐酸甲醇为提取溶媒。② 超声时间的考察：精密称取清肝颗粒约0.5g，加1%盐酸甲醇，分别超声处理10、20、30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，取3mL离心(10000r/分) 10分钟，取上清液按上述色谱条件分析，结果表明超声20min提取率最高，故选择超声时间为20min。
根据上述结果确定本品供试液的制备方法为：精密称取清肝颗粒约0.5g，加1%盐酸甲醇100mL，超声处理20分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，取3mL离心(10000r/分) 10分钟，即得供试液。
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2.2.3 阴性对照溶液 按清肝颗粒制剂处方，去黄连，按制剂工艺制成缺黄连阴性颗粒。精密称取约0.5g，按供试液制备法制备。
2.3 空白试验 取阴性对照溶液、对照品溶液和供试品溶液按上述色谱条件进样，色谱图见图 1、图 2和图 3。由图可见，缺黄连样品色谱在小檗碱相应保留时间上没有干扰峰，图 2和图 3中小檗碱和样品中其它组分色谱峰达到基线分离，小檗碱与相邻色谱峰的分离度大于1.5；按小檗碱峰计算，理论塔板数(N)大于8000。
2.4 线性关系的考察 取对照品溶液，再依次配成0.066mg/mL、0.033mg/mL、0.0165mg/mL、0.00825mg/mL系列对照品液。用5μL定量管的液相色谱仪进样器进样，以峰面积为纵座标(Y)，对照品量(μg)为横座标(X)进行线性回归，得回归方程： Y = 3718055.6X-26325.2，R2 = 1.0。结果表明小檗碱进样量在0.04125~0.660μg范围内呈良好线性关系。
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2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液5μL，重复进行5次，测得主峰峰面积，计算RSD为1.53%(n=5)，表明精密度良好。
2. 6 灵敏度试验 取对照品溶液依法稀释进样，得最低检测限为2ng(S/N=3)。
2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液5μL，分别于0、2、6、8及12h进行测定，结果12h内测定结果稳定，RSD为1.15%。
2.8 重复性试验 取同批样品(批号：20050820)5份，按供试液制备法制备，得5份供试液，依法测定，结果表明该法重复性良好，RSD为0.33%。
2.9 加样回收率试验 取重复性试验中含量已测定的清肝颗粒进行加样回收试验。精密称取约0.2~0.3g共六份，分别加入小檗碱对照品(样品含量的100%、80%和120%)，按供试液制备法制备得6份供试液，依法测定计算含量，平均回收率为99.21%，RSD为1.18%。测定结果见表1。
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2.10 样品测定 按拟定的含量测定方法，分别测定三批样品，以外标一点法计算测定小檗碱含量，结果见表2。
3 讨论
3.1 黄连为清肝颗粒方中的主药之一，从所测的3批样品的数据可知，其含盐酸小檗碱的量均能达到《中国药典)2005年版一部黄连项下的要求。故此法可作为控制此药品质量的一个重要指标。
3.2 检测波长的选择 盐酸小檗碱在 350nm处有最大吸收 ，灵敏度高，且杂质无干扰，故选择 350nm 为检测波长。
3.3 小檗碱是季胺型生物碱，极性较大，参考文献以不同比例的乙腈，磷酸二氢钾水溶液及磷酸为流动相。结果以“乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液-磷酸(40:60:0.2)”出峰时间短，峰形对称，故选为流动相。
3.4 实验中对提取方法中的提取溶媒、超声时间进行了考察 。结果表明 ：以1%盐酸甲醇、超声处理20分钟时，盐酸小檗碱提取率最高 。
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参考文献:
[1] 徐春雷.肠易激综合症的临床治疗观察，海南医学，2005，16(9)：92.
[2] 黄泰康.常用中药成分与药理手册.北京：中国医药科技出版社，1994,4.
[3] 高学敏.中药学上册.北京：人民卫生出版社,2000.
[4] 吕霞，王晶，等.黄连的研究进展.山东医药工业，2003，22(6)：33-35.
[5] 中华人民共和国药典一部[s].北京：化学工业出版社，2005：214., 百拇医药(柳春娣 刘晓燕 余 辉)