细胞因子在软骨细胞分化形成中的影响和作用
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摘 要目的：研究和评价转化生长因子-β1(TGF-β1)和胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)在BMG三维支架中对骨髓基质干细胞(SMCs)向软骨细胞分化的影响和作用。方法：分离骨髓基质干细胞，将无血清Mc5A培养液分为A'B'C'D 四组，先进行单层细胞培养，再置于松质骨基质明胶(BMG)支架中继续培养，然后进行甲苯胺蓝染色、蛋白多糖含量的测定。结果：各组单层细胞培养的细胞个数均有显著性差异，即A组﹥B组﹥C组﹥D组；第20天后各组的BMG支架蛋白多糖含量，即A组﹥C组﹥B组﹥D组(p﹤0.05)。结论：TGF-β1可提高骨髓基质干细胞的软骨分化能力，而IGF-Ⅰ可提高TGF-β1对骨髓基质干细胞软骨分化作用。
关键词骨髓基质干细胞；软骨细胞分化；细胞因子；(TGF-β1、IGF)
骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在特定条件下可诱导分化为软骨细胞，人体内骨髓中MSCs的含量极其稀少，因此体外纯化和扩增MSCs就显得尤为重要。这些干细胞经过培养传代扩增，向软骨细胞方向分化，最终形成软骨[1]。已证实一些细胞因子如成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF-β1)、胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)可以动员MSCs向软骨细胞分化[2]，我们同时应用TGF-β1和IGF-Ⅰ与MSCs结合进行培养，观察其对MSCs软骨分化作用，并与单纯应用TGF-β1和IGF-Ⅰ时对MSCs诱导分化的结果向比较。在自制的BMG支架中培养兔的骨髓SMCs，研究和评价TGF-β1+IGF-Ⅰ、TGF-β1、IGF-Ⅰ对骨髓SMCs向软骨细胞诱导分化的影响和作用。
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1材料和方法
1.1BMG的制备
在无菌条件下，切取2月龄新西兰大白兔髂骨，去筋膜及皮质骨，剩下的松质骨，用5mmol/L NaN3洗去血液，并浸泡24小时。用1:1氯仿甲醇反复脱脂直至液体清亮后，风浴挥发。1.0mmol/l 盐酸进行脱钙48小时，再次脱脂过夜，风浴挥发。依次用2mol/L CaCI2、0.5mol/L EDTA溶液浸泡、4mol/L LiCI连续抽提24小时，用三蒸水反复漂洗除去残余试剂。以无水乙醇无水乙醚脱水、制成松质骨基质明胶(BMG)呈海绵状，-20℃保存，使用前紫外线照射12小时灭菌。
1.2 MSCs分离
取健康2月龄大白兔2～2.5千克(华中科技大学同济医学院实验动物中心)雌雄不限。氯胺酮+异丙嗪肌注麻醉，双侧髂部剪毛后碘伏消毒，在无菌条件下用16号骨穿刺针在髂骨翼外侧穿入骨髓腔，针管内含有0.1ml肝素钠生理盐水，抽吸骨髓液6ml移入Mc5A培养液5ml的离心管内混匀，1500 r/min离心5分钟，弃上层脂肪和上清。加入适量无血清培养液悬浮细胞，缓慢移入盛有比重为1.077淋巴细胞分离液的离心管中，以2000 r/min离心20分钟，小心吸取界面的有核细胞乳白层，加入Mc5A培养液10ml，制成细胞悬液移入25cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，倒置显微镜下观察呈形态一致的均质的分布均匀的细胞,计数每瓶中含有1.5×105个细胞/ml时，收集的骨髓MSC低温存储。
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1.3培养和诱导MSC
将无血清Mc5A培养液分为A’B’C’D’ 四组：以每瓶中含有1.5×105个细胞/ml开始诱导培养，在24孔培养板中培养，分为四组，每组10个孔,孔内加入含有5 n g/ml TGF-β1和100ng/ml IGF-Ⅰ无血清Mc5A培养液作为A组，加入含有5 n g/ml TGF-β1无血清Mc5A培养液为B组，加入含有100ng/ml IGF-Ⅰ无血清Mc5A培养液作为C组，不加任何试剂的无血清Mc5A培养液作为D组作为空白对照组。第5天时进行细胞传代，并计数细胞个数。第10天细胞长满了瓶壁，在进行细胞传代，即用0.25%胰蛋白酶清洗贴壁的细胞，将未贴壁的死细胞及分泌代谢产物清洗倒出，再往瓶内加入0.25%胰蛋白酶3-5ml，放入培养箱中2-3分钟，观察瓶内贴壁的细胞已分离成为悬浮的圆形细胞，轻轻倒出胰酶，加入5ml上述的四种不同的无血清Mc5A培养液。在无菌条件下将约7×7mm2大小的块状BMG支架置入每个孔内，使悬浮的细胞液覆盖于支架上，第20天时观察BMG支架中细胞形态及分布，收集BMG支架低温储存。
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1.4统计学分析
实验所得的数据以X±S表示，行方差分析，统计学处理。
2实验结果
2.1细胞形态和生长情况
最初接种的骨髓细胞悬液中呈圆形、大小不一，24h后,沉淀于瓶底，部分较大的圆形单核细胞贴壁；48h后贴壁的单核细胞开始增多，部分变成椭圆形；72h后细胞出现纺垂形改变，A组和B组的贴壁细胞明显增多；第5天时换液，在换液过程中骨髓中的造血干细胞不会贴壁而逐渐清除掉，细胞逐渐形成分散的细胞集落，其形状与大小各不相同，多为成纤维样细胞形态(图1)。第8天以后C组含有IGF-Ⅰ的培养瓶中有核细胞增殖加快，细胞数量明显增加。D组培养瓶中有核细胞数量相对较少。第10天时各培养瓶中集落细胞不断扩增，形态多转化为长梭形，少数呈多角形、三角形，分布不均(图2)；观察细胞在BMG支架上爬满了细胞，呈团状或漩涡状生长，大量细胞长入松质骨海绵网孔内，且贴壁生长分布均匀(图3)。
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* 代表与空白对照组相比具有显著性差，MSC细胞个数均值和误差用X±S表示(p<0.05)。
统计学分析：第5天时A组与B、C、D组均有显著性差异，而B组与C组相比较亦有显著性差异；第10天时A、B、C组与空白对照组相比较均有显著性差异，A组与B、C组相比较亦有显著性差异，B组与C组相比较无显著性差异(p<0.05)。
2.2组织学检查
在所有组织切片中进行甲苯胺兰染色，显示细胞周围基质异染呈阳性，说明均含有蛋白多糖，其中A组异染性较强，B 组和C组次之，D组较差(图省落 )。
2.3GAG含量测定
第20天时通过二甲基亚甲基蓝比色法测定各组标本的GAG含量，天然关节软骨GAG含量为(50.46±7.50)mg/g。见表2。
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*代表具有显著性差异，A组与各组相比较有显著性差异，B、C组与D组相比较有显著性差异(P<0.05)
3讨论
3.1本试验鉴于BMG具有良好的组织相容性，呈三维立体结构，可塑性强，且含有生物活性物质，对软骨细胞有支持和诱导的双重作用，因此BMG支架有可能成为一种较理想的软骨细胞支架。Urist等[3]认为BMG植入软骨缺损中后，其所含的BMP与间充质细胞膜表面受体结合，使细胞膜表面电荷发生改变，DNA序列发生改变，激活基因调节因子，诱导出能产生软骨和骨的DNA合成。Reddi等[4]研究认为BMG引起局部蛋白溶解，释放趋化因子，使间充质细胞趋附，通过纤维粘连蛋白(Fibronectin)及相关的细胞粘附蛋白与基质粘附，BMG释放有丝分裂因子促进细胞生长，在BMP的作用下，使间充质细胞分化为软骨细胞和骨细胞。我们自制的BMG经过脱钙、去脂、去蛋白等处理，降低了抗原性，保留了诱导软骨分化的活性因子，并且具有良好的组织亲和性和结合力。细胞三维培养有利于维持其形状，保持软骨细胞的表型和刺激基质代谢合成。我们利用自制的BMG作为载体，分析不同诱导剂对骨髓基质细胞软骨化作用，在各组中均观察到随时间的变化细胞数量不断增殖，可以看出BMG支架具有良好的生物相容性，支持和促进细胞的分化和生长。BMG提供了软骨细胞的良好环境，使MSCs在孔隙中粘附、分化和生长，它既可作为成软骨的支架，又可成为诱导软骨分化的TGF-β1和IGF-Ⅰ的载体，使生物活性因子在支架微环境中维持必要的浓度和持续释放，以发挥诱导软骨分化的功效。, 百拇医药(孙 辉 刘俊宾)