银杏叶提取物对戊四氮诱导大鼠癫痫发作和Cav3.2表达的影响(1)
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【摘要】目的 探讨银杏叶提取物(GBE)对戊四氮(PTZ)慢性致痫大鼠模型癫痫发作的影响及脑保护作用。方法 健康成年雄性SD大鼠40只，随机分为4组：PTZ致痫组、PTZ+丙戊酸(VPA)组、PTZ+VPA+ GBE组、生理盐水(NS)对照组，每组10只，观察各组大鼠的行为学、脑电图(EEG)、电迷宫正确率和颞叶海马T型Ca2+通道Cav3.2表达变化。结果PTZ+VPA 组、PTZ+VPA+GBE组和NS组发作级别为0-Ⅱ级，EEG正常或少量棘慢波，EEG总功率差值及颞叶海马Cav3.2水平较PTZ组显著降低，差别有统计学意义(P<0.05)；相比于PTZ+VPA 组，PTZ+VPA+GBE组颞叶海马Cav3.2表达明显减少，差别有统计学意义(P<0.05)。结论 GBE能降低Cav3.2水平，显著降低癫痫大鼠发作级别、减少脑部异常放电和改善认知功能，有辅助抗癫痫和脑保护作用。
【关键词】戊四氮(PTZ)；银杏叶提取物(GBE)；丙戊酸(VPA)；脑电图(EEG)；电迷宫
癫痫是由大脑神经元突然过度异常放电所致的反复短暂中枢神经系统功能失常为特征的慢性疾病，严重危害人类健康。其发病机制复杂，治疗靶点多样。当前的研究趋势之一是寻找具有神经保护作用的新型抗癫痫药。近年来，具有明显神经保护作用的银杏叶提取物(GBE)广泛用于心脑血管疾病的防治，仅少量涉及GBE对癫痫的干预。本实验用GBE、VPA干预戊四氮致痫大鼠，通过对其癫痫发作、认知功能和T型Ca2+通道蛋白Cav3.2表达的观察，探究GBE对癫痫发作的影响及发作后脑损伤的保护作用。
1材料和方法
1.1试剂和仪器PTZ、Anti-Calcium Channel Cav3.2 (a1H)(Sigma公司)，兔SP检测试剂盒SP-9001(北京中杉金桥生物技术有限公司)，GBE(法国博福—益普生制药工业公司，含24%黄酮糖苷，6%萜类，其中银杏苦内酯占3.1%，白果内酯(又称银杏内酯)占2.9%)，日本光电4371F脑电图机，MG-20/3C 迷宫刺激器(张家港市生物医学仪器厂)，德国Lecia显微照像系统，Biosens Digital Imaging Systemv1.6分析系统。
1.2动物分组及模型制作成年雄性SD大鼠40只，体重250g左右，河南省实验动物中心提供，按随机数字表法分为4组，每组10只。PTZ致痫组、PTZ+丙戊酸(VPA)组、PTZ+VPA+ GBE组、生理盐水(NS)对照组，分别标记为A组、B组、C组、D组。A-C组按照Diehl[5]的方法制作大鼠点燃模型，即按35mg/kg腹腔注射(ip)10g/L PTZ生理盐水溶液，每日一次；B组在ip PTZ之前1小时给予丙戊酸80mg/kg[2]灌胃(ig)；C组在ip PTZ之前1.5小时给予银杏叶提取物100mg/kg[3] ，ip PTZ之前1小时给予丙戊酸80mg/kg ig；D组按3.5ml/kg腹腔注射生理盐水，每日一次。各组于每天下午3点开始用药，实验周期为8周，其中C组在腹腔注射PTZ之前的3天只给予GBE。
1.3观察方法
1.3.1 大鼠行为学评估指标根据Racine分级法观察痫性发作级别：0 级：无抽搐发作；Ⅰ级：面部痉挛；Ⅱ级：面部痉挛+节律性点头；Ⅲ级：面部痉挛+节律性点头+前肢阵挛；Ⅳ级：面部痉挛+节律性点头+前肢阵挛+后肢站立；Ⅴ级：面部痉挛+节律性点头+前肢阵挛+后肢站立+跌倒；连续3天出现Ⅳ级发作或达到Ⅴ级发作判定为完全点燃。观察并记录大鼠腹腔注射PTZ或生理盐水后1小时内，每只大鼠的行为学变化。
1.3.2 脑电图描记第八周末对40只实验大鼠进行EEG描记。方法为：用粗棉线套住大鼠4只脚固定于木板上，将3根特制针电极分别插入大鼠前额、左右颞叶部位头皮下，使三个插入点成为等腰三角形状，其中顶角为参考电极，用胶带固定电极和电线。
1.3.3 Y型电迷宫正确率测定第8周，对40只SD大鼠进行电迷宫测试。Y型电迷宫，又称三等分辐射式迷路箱,设置电压50-100V，延迟时间5秒。实验开始时，不通电，随机选择一臂作为起步区，将大鼠置于起步区，由于好奇心大鼠在三臂中探索3-5分钟，待大鼠稳定后将其放回起步区。选择起步区所之外任一区作为安全区，按下其对应的按键，安全区灯亮后5秒时，电刺激开始，大鼠最终逃到亮灯的安全区，30秒后熄灯，一次测试结束。
1.3.4 免疫组化染色在描记EEG后，各组大鼠10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔麻醉，10%甲醛全身灌注固定，然后断头取脑，将大脑置于10%甲醛中室温固定36小时，常规石蜡包埋。用切片机连续冠状切取颞叶海马脑组织，每片厚3μm。
1.4 统计学处理数据均为定量资料，结果用X+S表示。采用SPSS10.0统计软件对A-D组的EEG、电迷宫正确反应率和颞叶海马平均积分光密度进行分析，设定P<0.05有统计学意义。
2结果
2.1 行为学结果8周后，A组大鼠全部达到完全点燃，在注射PTZ后1-3分钟进入潜伏期，大鼠由自由活动状态渐转为安静或躁动，随后出现头面部肌肉抽动，伴点头、全身湿狗样抖动，继而出现前肢阵挛、后肢站立、头转向一侧，最后全身强直-阵挛发作，伴跳跃、撞笼、跌倒和舌咬伤。发作持续数分钟后可短暂缓解，反复发作。
2.2EEG结果组间注射前后总功率差值的分析：偏态分布、方差不齐，多组定量资料，Kruskal-Wallis检验 ， P<0.05，差别有统计学意义。组内注射前后总功率的分析：配对资料的t检验。EEG总功率差值的比较中，B、C、D组与A组的差别有统计学意义(P<0.05)，B组和D组的差别有统计学意义(P<0.05)。A组内注射前后的总功率的差别有统计学意义(P<0.05)。即：PTZ致痫大鼠发作前后EEG功率差异明显，单用VPA、联用VPA和GBE对癫痫EEG都有影响；但是相比于正常组，单用VPA治疗EEG改变不明显。
2.3 Y型电迷宫测试结果第8周末，测得各组大鼠行为正确率数据，多组定量资料的Kruskal-Wallis秩和检验，见表1。A、B、C组与D组的差别有统计学意义(P<0 ......
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