血浆盐酸二甲双胍的检测及药物动力学研究
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【摘要】目的 建立高效液相色谱法测定人血浆中盐酸二甲双胍浓度的方法。方法 血浆样品用10%高氯酸沉淀血浆蛋白后，以苯乙双胍为内标物，高速离心后取上清液进行分析。色谱柱为lunaC8(4.3mm×280mm，6μm)，柱温为37℃，流动相为乙腈—磷酸盐缓冲液(含0.1%十二烷基硫酸钠和0.1%三乙胺，pH6.5)一乙腈(62:38)流速为0.9ml/min，检测波长：287nm。结果 盐酸二甲双胍的浓度在0.08～6.00mg/L范围内线性关系良好，回归方程为Y=0.7002C+0.0008(r=0.9698)，日内和日间精密度(RSD)均小于10%；检测限为0.6ng；检出浓度为45ng/ml～1150ng/ml。结论 本方法操作简便，适用于盐酸二甲双胍血药浓度的测定及药物动力学研究。
【关键词】盐酸二甲双胍；高效液相色谱法；血药浓度
盐酸二甲双胍(metofrminhydrochloride，MH)是双胍类降糖药，可用于单纯饮食控制和/或运动疗法血糖水平未得到满意控制的Ⅱ型糖尿病病人；亦可作为单用磺脲类或盐酸二甲双胍治疗 血糖水平未得到满意控制的Ⅱ型糖尿病病人的二线用药的降糖药。主要机制为抑制糖的吸收、增加糖的利用和异生，与磺脲类降糖药相比，盐酸二甲双胍不增加体重。且耐受性好。对于血中盐酸二甲双胍其浓度测定，国内外多见报道[1]。本实验依托各相关文献研究的基础，改良并建立起一种高灵敏度且操作步骤简单的高效液相色谱法测定盐酸二甲双胍血浆浓度的方法：
1试药与仪器
1.1药品与试剂
盐酸二甲双胍片剂制粉，含量99.6%(贵州天安药业股份有限公司提供)；内标苯乙双胍(山东科源)；高纯色谱级别乙腈；MKP、N,N-二乙基乙胺、发泡粉(天津)、磷酸等均为分析纯；三蒸水为本药剂科室自制。
1.2仪器
日本岛津LC-6A型高效液相色谱仪，sPD 6AV紫外可见光检测器(日本岛滓)，LG-6A泵和C-R6A积分仪、CT06A柱温箱、手动进样阀，WH-2000色谱工作站；AG285电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；恒温水箱(江苏中大420型)；DT5-2自动平衡台式离心机(北京时代)；XW-80A旋涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)，微量进样器。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为lunaC18(4.3mm×280mm，6μm)，流动相为：乙腈一磷酸盐缓冲液(31.25mmol/l)为62:38，流速为0.9ml/min。，柱温为37℃，检测波长为305nm。实验表明，在上述色谱条件下血浆中杂质对盐酸二甲双胍的测定无干扰。
2.2标准溶液的配制
精密称取阴凉存放的粉剂盐酸二甲双胍50mg，双蒸水稀释溶解于容量瓶中，继续加双蒸水至50ml刻度并混匀，储备液(1g/L)保存备用。以此为母液基础，逐级梯度稀释，将之定浓度为0.5、1、2.5、5、10、25、50mg/L各系列标注浓度。将内标物苯乙双胍精确称取10mg，溶解于50ml容量瓶中，三蒸水稀释至刻度混匀制备得到苯乙双胍储备液；再吸取苯乙双胍储备液5ml，置于容量瓶中，用25ml双蒸馏水稀释至刻度，混匀，制备得浓度为40mg/L内标标准液。
2.3血样采集与预处理
口服盐酸二甲双胍且无其它合并用药一周以上患者，晨起空腹静脉采血，注入EDTA抗凝真空采血管，离心3000rpm/min，10min，分离血浆。精密量取血浆样品0.2ml，加入100ul 10%高氯酸振荡混合，置1.5ml的EP-Tubes管中，加入内标溶液20μl，振荡混合均匀，再精密量取加入乙腈0.18ml，旋涡混合2min，放置5min；13000rpm离心时间为20min，取其上清液20 微升进样。
2.4方法学验证
2.4.1专属性
我们发现基于上述色谱条件下，盐酸二甲双胍和苯乙双胍的保留时间分别为5.5min和13.5min，两组分之间呈峰形对称，其标准像达基线分离。血浆中内源性物质如实验研究所示未显示影响二甲双胍、苯乙双胍出峰时间及高程。
2.4.2标准曲线及线性范围
本实验研究中我们分取梯度浓度各级别浓度的标准液，用阴性对照血浆按10倍稀释的方式，制得浓度分别为0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、及50mg/L的盐酸二甲双胍血浆样品，按2.3项下依照本实验提供样本和研究方法操作，分别记录各组分峰高、色谱图，用统计软件计算峰高比(也有文献用grams进行分峰，计算两峰的面积比值)。设定横坐标为MH血浆浓度数值，纵坐标为待测物与内标物的峰高比值，根据试验数据进行最佳配线，配线后进行F测验显著性，并采用加权最小二乘法求回归运算，求得标准条件下常规直线回归方程，即标准曲线为Y=0.6998C+0.0007(r=0.9697)；根据标准曲线，本方法的线性范围为0.08～6.00mg/l。
2.4.3准确度
阴性对照血浆制备浓度分别为0.075、1.0及3.75mg/L的MH血浆样品，按2.3项所示方法操作测定，与标准测量曲线同时进行，由同日的标准测量曲线精确到0.01位数求出各样品的浓度，对比所求得的浓度与已知浓度，计算样品的方法其回收率见表1。
表1血浆中盐酸二甲双胍的绝对回收率(x±s，n=5)
P<0.05
2.4.4精密度
在日内和日间(5天)对应每种浓度做样品，分别于日内间隔2h测定数次，并连续测定数日记录色谱图，求得日内和日间相对标准偏差。测定的日内变异(n=7)其盐酸二甲双胍浓度分别为3.75，1.0及0.075 mg/L；测定的日间变异(n=7)其盐酸二甲双胍浓度分别为3.75，1.0及0.075mg/L时，两者的RSD见表二。
表2血浆盐酸二甲双服的实验方法精密度(n=5)
2.4.5检测限值
用浓度为0.5mg/L盐酸二甲双胍标准溶液配置浓度分别为0.015、0.03、0.045 mgL的血浆样品，预处理后进样：以空白血浆为对照，按信噪比S/N=2测得本方法中盐酸二甲双胍的最低检测限为0.6ng；根据实验精密度的要求，在本实验条件下，测得人血浆中盐酸二甲双胍的最低定量浓度为45g/L(n=5，RSD=9.18%)
3 讨论
国内外文献报道有关测定血中MH药物浓度的方法,有实验研究方法多种但有的手法繁复，耗时长，有的操作简单却数据有失精准，却以高效液相色谱法应用最为广泛并且最为准确和简便。我们采用10%高氯酸作为蛋白沉淀剂，沉淀后能直接进样测定，简化了样品处理过程。本方法简便、快速、准确、专一性好，可用于盐酸二甲双胍的血药浓度测定。因MH是双胍类降糖药其极性较大，其保留反相色谱中能力较弱[2]。本实验创新改用离子对色谱法利用二甲双胍与发泡剂(SDS)能直接结合为离子对而保留反相色谱中能力得到大幅度增强 ......
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