跌打止痛散质量标准的研究
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【摘要】目的：建立跌打止痛散质量控制方法。方法：采用TLC法对红花、当归、赤芍进行定性鉴别；采用HPLC法测定跌打止痛散中大黄素的含量，选用Hypersil C18色谱柱，流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液(85:15)，检测波长254nm。结果：TLC检出了红花、当归、赤芍特征斑点；大黄素在0.0375～0. 375μg范围内线性关系良好(r=0.9996)；加样回收率为98.11%，RSD=1.40%。结论：方法简便、灵敏、重复性好，可作为该制剂的质量控制标准。
【关键词】跌打止痛散质量标准HPLC法大黄素
跌打止痛散收载于《卫生部药品标准.中药成方制剂》(WS3-B-1444-93 )[1]，由红花、大黄、儿茶、三七 等13味药组成，具有散瘀止痛的作用，临床用于用于跌打损伤，瘀滞肿痛的治疗疗效显著。标准中只收载了显微鉴别项，无薄层鉴别及含量测定监控指标,难以控制其内在质量。本文对其定性、定量方法进行探索，现将结果报道如下
1仪器、试药与材料
Agilent1100高效液相色谱仪(美国HP公司)，大连依利特色谱柱(Hypersil ODS24.6 ×200mm，5μm)。甲醇、磷酸为色谱纯；水为重蒸馏水；其它试剂均为分析纯。药材购自湖南海川医药有限公司；人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1对照品(批号：110703-200424、110704-200420、110745-200517)、芍药苷对照品(批号：110736-200629)、大黄素对照品(批号：110756-200110，供含量测定用)、红花对照药材(批号：120907-200609)均为中国药品生物制品检定所提供。跌打止痛散样品为鞍山制药有限公司(批号分别为20100905、20101010、20101012、20101014、20101205、20101211)。
2方法与结果
2.1薄层鉴别研究
2.1.1红花取本品5g，加80%丙酮溶液20mL，超声处理30min，滤过，取上清液作为供试品溶液。另取红花对照药材0.5g，同法制备对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7：2：3：0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。见图1。
2.1.2三七取本品5g，加水2ml，搅匀，再加以水饱和的正丁醇5ml，密塞，振摇10分钟，放置2小时，离心，取上清液，加3倍量以正丁醇饱和的水，摇匀，离心，取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5?l，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂,展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的斑点。见图2。
2.1.3赤芍取本品5g，加乙醇30mL，超声处理15min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取赤芍对照药材0.5g，同法制备对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40：5：10：0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，105℃加热至显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。见图3。
图1 红花TLC彩照图2 三七TLC彩照 图3 赤芍TLC彩照
2.2大黄素含量测定[2、3]参考《中国药典》2010年版一部大黄项下大黄素的含量方法及相关文献资料进行测定。
2.2.1色谱条件与系统适用性试验大连依利特色谱柱(Hypersil ODS24.6 ×200mm，5μm); 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%磷酸溶液(85:15)为流动相；检测波长为254nm；柱温28℃；分离度大于1.5，理论板数按大黄素峰计算应不低于2000。
2.2.2供试品溶液制备取本品约1g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇100ml，加热提取至提取液无色，取提取液，置水浴上蒸干，残渣加2.5mol/ml硫酸溶液10ml溶解至锥形瓶中，加氯仿10ml，加热回流1小时，放冷，移至分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿提取3次，每次10ml，合并氯仿液，以无水硫酸钠脱水，氯仿液挥干，残渣加甲醇使溶解，置20 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45um微孔滤膜滤过，既得。
2.2.3阴性样品溶液的制备取缺大黄的阴性样品适量，同供试品制备方法制备阴性样品溶液。
2.2.4对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品适量，加甲醇制成每1ml含15ug的溶液，即得。
2.2.5测定法取供试品溶液、大黄素对照品溶液及阴性样品溶液各10ul，分别注入液相色谱仪，检测，记录色谱图。结果表明，阴性对照对本品的测定无干扰。结果见图4。
图4 跌打止痛散HPLC色谱图
2.2.6方法学考察 线性关系精密吸取浓度为15μg /ml的大黄素对照品溶液2.5、5、10、15、20μl注入液相色谱仪,测定其峰面积积分值，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：Y＝97058x+2527 ，r＝0.9996。结果表明，大黄素在0.0375～0.375μg范围内具有良好的线性关系。
精密度试验精密吸取同一供试品溶液10μl,连续进样6次，测定峰面积积分值，其RSD为0.72%。
稳定性试验分别精密吸取同一供试品溶液10μl，分别于0、4、8、12、16、20小时进行测定。结果峰面积积分值RSD为1.48%，大黄素在20小时内稳定。
重复性试验取同一批号(批号：20100915)供试品约1g，共6份，同前制备供试品溶液，依法测定，结果平均含量为0.281mg/g,RSD为2.17%。
回收率试验取已知含量为0.0281%(批号：20100915)的样品约0.5g，共6份，精密称定，分别精密加入大黄素对照品溶液(15ug/ml)10ml，即0.15mg，按含量测定项下的方法测定含量，结果见表1。
表1加样回收率试验结果
2.2.7样品测定取跌打止痛散，按制定含量测定方法对6批样品进行了测定，结果见表2。
根据6批跌打止痛散样品中大黄素含量测定结果，结合大黄药材大黄素含量结果，暂定本品中大黄素含量不得低于0.20mg/g。
3讨论
3.1本文薄层鉴别中 ......
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