高效液相色谱法测定人血浆中连翘苷含量
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【摘要】 目的 建立高效液相色谱法，用于测定人血浆中连翘苷的质量浓度。方法 采用内标法， 以ThermoC18柱(4.6mm×250mm，5μm)为固定相，以乙腈-水-冰醋酸(17：83：0.4 ) 为流动相，流速为1mL/min，检测波长为277nm。 结果 血浆中连翘苷质量浓度在0.10～4.00μg/ml范围内与峰面积比值线性关系良好(R2= 0.999) ，最低检测浓度为0.05μg/ml，回收率达90%以上。结论 该方法具有较高的准确度，线性范围宽，方法灵敏，专一性好，操作简便，适用于连翘苷血药浓度的测定及临床药代动力学研究。
【关键词】 高效液相色谱法；连翘苷； 血药浓度
HPLC determination Of Phillyrin in Human Plasma
QIN Ying-pu1，MO Wu-ming2
1.Guangxi Wuzhou People’s Hospital, Wuzhou 543000, China; 2.Guangxi Wuzhou Sanjian Pharmaceutical Co., Ltd，Wuzhou 543001, China;
【Abstract】 Objective To determine the concentration of Phillyrin in human plasma by HPLC with ultraviolet detetion.Methods The internal standard method was used.The evaluation of Phillyrin was car ried out by ThermoC18 colum (4.6mm×250mm，5μm)with the mobile phase ofAcetonitrile - water - acetic acid (17：83：0.4 ) and the detection wavelength was 277nm.The flowrate was 1 mL/min.Results The calibration curve for plasma Phillyrin in range of 0.10～4.00μg/ml (R2= 0.999).The detection limit of Phillyrin was 0.05μg/ml.The recovery was more than 90%.Conclusion This method is accurate，sensitive，specific and convenient，which could be used in the determination of plasma Phillyrin and its pharmacokinetic study in clinic.
【Key words】 HPLC；Phillyrin；blood drug concentration
连翘，又名旱莲子(《药性论》)、大翘子(《新修本草》) ，为木犀科植物连翘Forsythia suspense(ThunbVah1)的干燥果实。味苦微寒，归肺、心、小肠经，具有清热解毒、消肿散结的功效，主治痈疽、乳痈、丹毒风热感冒、湿病初起、高热烦渴、神昏发斑、热淋尿闭。主要分布于山东、山西、陕西、河南等省[1]。连翘苷是连翘中有效成分之一，研究表明连翘苷具有降血脂、减肥、抗菌等多种药理作用[2]。
为了深入研究连翘的药理活性机制，需要对连翘苷进行药物动力学的研究，而建立生物样品中连翘苷的定量分析方法是开展药物动力学研究的前提条件，因此本研究建立了一种检测人血浆中连翘苷的方法， 以便在此基础上进一步研究连翘苷的药物动力学特征。
1 仪器与试药
岛津20A液相色谱仪，岛津SPD20A紫外检测器，威玛龙色谱数据工作站；FA1004型分析天平(上海天平仪器厂)；
连翘苷对照品(批号171237-200304，中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用)。
黄芩苷对照品(批号110715-200815，中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用)。
乙腈为色谱纯；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：ThermoC18柱(4.6mm×250mm，5μm)； 流动相：乙腈-水-冰醋酸(17：83：0.4 )；流速：1mL/min；检测波长：277nm；进样量：20μL；柱温：30℃。
2.2 对照液及内标溶液的配制 连翘苷对照品溶液：精密称取连翘苷对照品10.0mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为0.4mg/ml的连翘苷对照品贮备液。置冰箱4℃保存。内标液：精密称取黄芩苷对照品10.1mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为0.404mg/ml的黄芩苷对照品贮备液。临用前用相应溶剂稀释至所需质量浓度，即得。
2.3 血浆样品制备与测定 精密量取人血浆样品200μl，置离心管中，加入内标黄芩苷的甲醇溶液( 100μg/ml ) 20μl，旋涡混匀2min再加入200μl乙腈，以10000r/min离心5min，吸取上清液20μl进样，按拟订的色谱条件分离测定，记录色谱图和峰面积。
2.4 分析方法验证
2.4.1 线性范围 取连翘苷储备液分别稀释成0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，2.00，4.00μg/ml系列标准液，向6支具塞离心管中分别准确加入200μl连翘苷标准液，将离心管于45℃水浴中氮气流吹干。再向上述每个离心管中各加入200μl空白血浆， 按照“2.3项下血浆样品制备与测定” 处理后进样分析。以峰面积比A样/A内为纵坐标、连翘苷质量浓度 (μg/ml) 为横坐标进行线性回归，得标准曲线方程Y= 1.9646C + 0.008，R2= 0.999( n= 7 ) 。 结果表明，连翘苷质量浓度线性范围是0.10～4.00μg/ml。人空白血浆、血浆样品色谱图见图1、图2。检测限约为0.05μg/ml (S/N≥3 ) ，定量限为0.10μg/ml。
图1 人空白血浆色谱图
图2 (连翘苷+黄芩苷)血浆样品色谱图
1 连翘苷色谱峰 2 黄芩苷色谱峰
2.4.2 回收率试验 取0.1ml血浆，分别配制成高、中、低3种质量浓度(0.10，0.80，4.00μg/ml)的连翘苷血浆样本各6份。按“2.3”项下操作，测定药物峰面积。另流动相配制相应等浓度的连翘苷溶液，测定药物峰面积。将血浆样品的峰面积除以相应等浓度对照品溶液峰面积，即得绝对回收率。低、中、高3种浓度的平均绝对回收率分别为98.34%、95.27%、97.05%，RSD均小于15%。连翘苷在血浆中的回收率达90%以上，说明该药物在人血浆中回收率较好，符合检测要求(见表1)。
2.4.3 精密度试验 按回收率项下方法配制连翘苷碱血浆 ......
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