复方地黄汤剂对痴呆小鼠脑神经元超微结构影响的研究
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【摘 要】 目的：探讨复方地黄汤对老年痴呆的作用途径，分析探讨其疗效作用。方法：快速老化小鼠随机分为三组：实验组，治疗组，模型组。实验组给予复方地黄混浊液2ml/d 灌胃，治疗组给予脑复康水溶液2ml/天，500mg/kg体重(75片/300ml纯净水)，正常对照组采用健康昆明种小鼠，和模型组用生理盐水2ml/天灌胃， 以上均为每天分次给药，灌胃3周，每隔3天休息1天。3周后,各组小鼠进行行为学测试及电子显微镜观察神经元细胞形态的变化。结果 实验组和治疗组潜伏期明显缩短、过台次数增加,与模型组相比具有差异(P < 0.05) 。超微结构复方地黄组海马神经元损伤轻微，大部分核膜清楚完整，细胞核染色质基本呈正常分布，核周间隙清晰可见。大部分细胞器清晰可见，神经纤维较丰富、排列有序，突触膜清晰，突触间隙不清，突触小泡较多。髓鞘较致密。结论：复方地黄能够提高快速老化小鼠的学习和记忆能力,在形态结构上能减少脑组织神经元的损伤。
【关键词】 复方地黄汤；学习记忆力；超微结构；神经元
随着世界人口老龄化的发展，老年性痴呆(以阿尔茨海默病AD为主)成为老年人常见病 [1]。其病因复杂, 发病机制至今仍不清，目前国内外尚无特效方法和药物进行治疗，而祖国医学对于老年痴呆的治疗却积累了丰富的经验，属于肾精亏虚、痰浊阻窍、淤血阻滞，我们以“益肾健脾、祛痰清瘀”为基本治则[2-3]，复方地黄汤有益肾健脾、祛痰清瘀、滋阴养血的作用, 可以作用多系统、多环节，之前研究用此药物防治AD, 已取得较好的效果[4-5]。在前期研究工作的基础上,观察复方地黄汤对老年痴呆小鼠的作用效果,分析探讨复方地黄汤具体作用机制和疗效。
1 材料和方法
1.1 实验动物：30只快速老化小鼠,9个月龄(体重25±2g) ,均是雄性,天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供，10只健康昆明种小鼠10月龄,均是雄性,黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2 实验材料：复方地黄由熟地黄、龟板、山茱萸、丹参、何首乌、茯苓、泽泻、石菖蒲、远志等组成,汤剂由齐齐哈尔医学院药物研究所提供；吡拉西坦片(脑复康 )国药准字 H23020601 哈尔滨泰华药业股份有限公司； MORRIS水迷宫由中国医学科学院药物研究所提供；
1.3 动物分组及给药：快速老化小鼠随机分为三组,每组10只，分别是模型组、地黄组、治疗组。健康昆明种小鼠10只为空白对照组。地黄组用复方地黄混浊液2ml/ d (生药475mg/ ml) 灌胃；治疗组用脑复康水溶液2ml/天，500mg/kg体重(75片/300ml纯净水)，正常对照组采用健康昆明种小鼠，和模型组用生理盐水2ml/天灌胃， 以上均为每天分次给药，灌胃3周，每隔3天休息1天,3周后,进行各项实验。
1.4 Morris水迷宫实验：各组动物在给药3周后,依文献[6]方法进行Morris水迷宫训练7天,期间继续给药,训练7天完成后，测验小鼠寻找平台的潜伏期、跨越平台次数以及在原平台象限游泳距离与总游泳距离的比例。
1.5 电镜超微结构观察：取各组剩下小鼠鼠脑进行电镜标本制作：经取材，固定，包埋成块，修块、定位；超薄切片机切片，厚约500A；醋酸铀及构椽酸铅双染色；电镜下海马结构观察
1.6 统计学方法: 数据以均数±标准差( ±s)表示, 以SPSS 170.0 统计软件分析, 计量资料采用t检验分析, P<0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Morris 水迷宫实验各组小鼠寻找平台的潜伏期、跨越平台次数以及在原平台象限游泳距离与总游泳距离的比例,模型组与空白对照组比较,寻找平台的潜伏期长,差异显著(P < 0.05) ，表明模型鼠空间探索能力下降。而实验组和治疗组潜伏期明显缩短、过台次数增加,与模型组相比具有差异(P < 0.05) , 说明防治有效。各给药组与模型组比较,在原平台所在象限游泳距离与总游泳距离的比值更大,差异有显著(P < 0.05) , 表明各给药组对原平台象限的记忆较模型组好,即对SAM - P/ 8 小鼠有增强记忆作用,见表。
Morris water maze test results in mice ( ±s)
groupNumber
(single)LatencyJump numbert 4/ t总(%)
Experimental group
Treatment group
Model group
Control group10
10
10
1025.2±4.1*
27.8±3.6
32.4±3.5
37.6±3.12.52±0.49
1.49±0.82
2.74±1.04
2.91±1.0125.38±5.46
24.10±4.28
18.34±5.56
16.50±3.37
Note: Compared with model group * P <0.05
2.2 透射电镜下观察海马CA1区，正常组海马锥体细胞基本呈正常结构，核膜完整，染色质分布正常。线粒体清晰，粗面内质网结构清晰，有丰富的核糖颗粒，海马内神经纤维丰富、排列有序。(图1)。模型组则显示海马区神经元损伤严重，部分细胞固缩，核膜较模糊不清，有异染色质呈边集现象，核膜相对完整。有较多脂褐素沉积于胞体内。神经细胞周边水肿，细胞器结构不清，神经纤维结构松散。(图2)。治疗组海马神经元结构较完整清晰，大部分核膜较清楚，细胞核染色质基本呈正常分布各种细胞器可见，变性很少。(图3)。地黄组海马神经元少量受损，大部分核膜清楚完整，细胞核染色质基本呈正常分布，核周间隙清晰可见。线粒体，溶酶体，高尔基体等细胞器可见，空泡样变很少见海马内神经纤维较丰富、排列有序，神经毡内轴突内神经丝较痴呆组明显增多；突触前、后膜清晰，突触间隙不清，突触小泡较多。髓鞘较致密。(图4)。
电镜图1 电镜图2
电镜图3 电镜图4
3 讨论
目前国内外对于AD的病因并不很清楚，治疗的方法和药物仅限于对症治疗和改善症状。各个国家都投入大量的人力和物力对AD的病因和治疗进行研究，祖国传统医学对AD的治疗积累了丰富的实践经验，本病是脾肾亏虚为本，气滞血瘀，痰湿阻滞为标，气滞血淤中,气血不足是形成痰浊淤血的病因, 痰浊淤血又使脏腑功能紊乱, 加速气血亏损。我们在传通经典六味地黄丸的基础上增加石菖蒲、何首乌、龟板等中药成分，形成新的复方地黄制剂，目的在于克服其原有促皮质激素样作用。复方地黄以熟地黄、龟板为君,滋补肾阴,肾主骨生髓充脑；次用人参、山茱萸、山药、何首乌为臣,以补脾气益肾精,君臣共济,气阴两生；再用茯苓、泽泻、牡丹皮、丹参为佐,调和五脏气血,不使滋补太过；最后用石菖蒲、远志为使,以引药入清窍,充脑安神。本研究是在前期工作基础上，继续观察复方地黄对痴呆模型小鼠的作用，小鼠Morris水迷宫测试表明,复方地黄汤可以明显缩短实验组小鼠的潜伏期,改善其学习记忆能力,模型组与空白对照组比较,寻找平台的潜伏期长,差异显著(P< 0 ......
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