当前位置: 首页 > 期刊 > 《中医药临床杂志》 > 2011年第20期 > 正文
编号:12129774
中药含药血清对MRSAβ-内酰胺类抗生素耐药性及mecA\femA基因的影响
http://www.100md.com 2011年10月15日 王禹 于清宏等
第1页

    参见附件(2222KB,2页)。

     【摘 要】 目的:研究中药在体内对MRSAβ-内酰胺类抗生素耐药性的影响。方法:采用中药含药血清与MRSA共同培养的方法进行耐药性逆转实验,用K-B纸片扩散法观察实验前后受试菌抑菌环直径的变化,同时进行耐药基因mecA、femA的检测。结果:对照组与实验组K-B纸片扩散法对比,五倍子、绿茶、防风、丹皮、黄芩、浙贝组对苯唑西林钠、头孢唑啉钠、头孢呋辛、头孢噻肟钠、头孢美唑等药物抑菌环直径扩大均有不同程度扩大,由耐药或中敏恢复为敏感;对青霉素抑菌环直径无影响,仍表现为耐药。MRSA标准菌株、对照组菌株均检测出耐药特异性基因mecA、femA,丹皮、五倍子、防风、黄芩、浙贝、绿茶组未测出femA基因, mecA基因条带显示明显减弱。结论:MRSA经五倍子、绿茶、防风、丹皮、黄芩、浙贝含药血清处理后均恢复了对耐酶β-内酰胺类抗生素的敏感性,且耐药基因mecA、femA的表达明显受抑制,推测其可能通过作用于mecA、femA或其调控因素,影响耐药基因的表达程度, 使PBP2a产生减少或消除,从而达到耐药性逆转的作用。

    【关键词】 中药;MRSA;β-内酰胺;耐药;基因

    耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin resistant staphyloc occus aureus,MRSA)是医院感染的重要病原菌之一。自1961年英国的Jevons首次报道MRSA感染以来,其发生率在全球范围内迅速增加,耐药程度不断加深。对于MRSA的治疗方法,虽然在新药研制与联合用药等方面有一些进展,但万古霉素仍然是临床首选药物。随着对万古霉素中敏或耐药金黄色葡萄球菌菌株(VISA/VRSA)的出现[1],对抗生素的选择余地已越来越小,因而一部分学者将目光转移到耐药性逆转药物的研究上。近年研究发现,部分中药与抗生素联合应用可增强对MRSA的治疗效果,并对其耐药质粒有消除作用。本研究选用五倍子、防风、丹皮等中药含药血清对MRSA进行耐药性逆转试验,以观察中药在体内对MRSAβ-内酰胺类抗生素耐药性的影响。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 MRSA标准菌株(ATCC43300)由卫生部临床检验中心惠赠,MRSA临床分离菌株由沈阳军区医学检验中心提供(K-B纸片扩散法苯唑西林抑菌环直径≤10mm,头孢西丁≤19mm)。

    1.1.2 中药 五倍子、防风、黄芩、浙贝、丹皮等14种中药购自辽宁中医学院第三附属医院药剂科。

    1.1.3 动物 Wistar大鼠购自沈阳军区总医院动物实验科。

    1.1.4 试剂 M-H培养基(BD公司)、抗生素药敏纸片(北京天坛药物生物技术开发公司)、DNA提取试剂盒(上海博亚生物技术有限公司)、PCR引物(上海博亚生物技术有限公司)。

    1.1.5 仪器 LIGHTCYCIER荧光定量PCR检测仪(罗氏公司)、DY-A电泳仪(上海生化所西巴斯生物技术开发公司)。

    2 方法

    2.1 中药煎剂制备 每味中药各100g,参考文献[2]方法分别煎煮至100ml药液。

    2.2 含药血清制备 Wistar大鼠60只,♂♀各半,体重200±20g,每4只分为1组,共15组。对照组灌服生理盐水,实验组分别灌服单味中药煎剂(相当于生药5g/kg),2次/日,共5日。末次给药2小时后眶内采血,无菌分离血清,将各组4只大鼠的血清混合备用。

    2.3 耐药性逆转试验 各组取4ml含药血清加入5mlM-H肉汤中,37℃培养48h,取50μl培养物进行药敏试验, 选用苯唑西林钠、青霉素、头孢唑啉钠、头孢噻肟钠、头孢呋辛、头孢美唑等抗生素药敏纸片,采用WHO推荐的K-B纸片扩散法,观察对照组与实验组抑菌环大小的差异,以筛选出在体内对MRSA有逆转作用的单味中药。

    2.4 耐药基因检测

    2.4.1 模板DNA制备 各组取4ml含药血清加入5mlM-H肉汤中,37℃培养48h,划线法接种于M-H培养皿,37℃培养24h, 挑取单个MRSA菌落至10mlM-H液体培养基中37℃振荡过夜,离心收集细菌。DNA提取过程按试剂盒说明进行。

    2.4.2 PCR扩增 参考文献[3]方法。mecA基因引物P1:5′TGGCTATCGTGTCACAATCG 3′,P2:5′CTGGAACTT GTTGA GCAGAG 3′,产物长310bp;femA基因引物P1:5′CTTACTT ACTGGCTGTACCTG3′,P2:5′ATGTCGCTTGTTATGTGC3′,产物长686bp。扩增总体积为25μl,其中包括:10×PCR缓冲液2.5μl、10mM4×dNTP2.5μl、15mMMgcl21.5μl、引物各1.25μl (50pmol/L)、DNA模板2.5μl、TapDNA酶0.1μl(1U)及无菌蒸馏水10.9μl。以无菌石蜡油30μl覆盖液面,于92℃预变性3min,92℃60s、56℃60s、72℃60s,共30个循环,最后于72℃延伸3min。

    2.4.3 扩增产物的鉴定 取扩增产物10μl,进行1%琼脂糖凝胶(含EB)电泳(110V、30 min),于紫外灯下观察结果并照相。

    3 结果

    3.1 逆转试验 对照组与实验组K-B纸片扩散法对比,五倍子、绿茶、防风、丹皮、黄芩、浙贝组对苯唑西林钠抑菌环直径扩大8-12mm,对头孢唑啉钠抑菌环直径扩大2-8mm,头孢呋辛抑菌环直径扩大2-14mm,头孢噻肟钠抑菌环直径扩大6-16mm,头孢美唑抑菌环直径扩大4-6mm,均由耐药或中敏恢复为敏感;对青霉素抑菌环直径无影响,仍表现为耐药。见下表。

    纸片扩散法抑菌环直径(mm)

    RS对照组黄芩组浙贝组丹皮组防风组绿茶组五倍子组

    苯唑西林钠≤10≥136161418161814

    青霉素≤28≥2910101010101010

    头孢唑啉钠≤14≥1816221818181824

    头孢呋辛≤14≥1818202024322622

    头孢噻肟钠≤14≥2314202020302820

    头孢美唑≤12≥1612161618161616

    3.2 mecA、femA基因检测 MRSA标准菌株、对照组菌株均检测出耐药特异性基因mecA、femA,丹皮、五倍子、防风、黄芩、浙贝、绿茶组未测出femA基因, mecA基因条带显示明显减弱。见下图。

    abcdefghijklmnopq

    a.Marker;b.MRSA质控菌株;c.对照组; d.丹皮;e.白果;f.赤芍;g.川芎;h.五倍子;i.防风j.蝉蜕;k.知母;l.白术;m.黄连;n.丹参;o.黄芩;p.浙贝; q.绿茶

    4 讨论

    敏感金黄色葡萄球菌有4种青霉素结合蛋白PBPs,即PBP1、2、3和4,它们具有合成细菌细胞壁的功能。β-内酰胺类抗生素通过与细菌内膜上PBPs结合,抑制转肽酶的转肽作用,干扰细菌细胞壁的生物合成,导致细菌溶菌死亡,从而达抗菌作用。MRSA对β-内酰胺类抗生素的耐药机制主要有两种:一是可产生β-内酰胺酶,分解β-内酰胺类抗生素, PBPs可正常行使功能,细菌继续生长 ......

您现在查看是摘要介绍页,详见PDF附件(2222KB,2页)