弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl-6基因重排的临床病理意义
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【摘要】 研究弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)生发中心组(GCB)和非生发中心组(non-GCB)的bcl-6基因重排、Bcl-6蛋白表达之间无直接相关性，在DLBCL的发病机制中作用各异。
【关键词】 淋巴瘤；bcl-6基因重排；荧光原位杂交；免疫组化；组织微阵列
DLBCL是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)中最为常见的组织学类型,在欧美和日本占成人NHL的30%～40%[1]。许多NHL有特征性的染色体异常，这些异常能帮助辅助诊断疾病并与其它疾病鉴别。如滤泡性淋巴瘤有t(14;18)，影响bcl-2基因；伯基特淋巴瘤有t(8;14)，影响c-myc基因；位于3q27的bcl-6基因的重排，通常见于DLBCL[2]。bcl-6基因由于在DLBCL中涉及3q27染色体易位而得以克隆，也称LAZ3或bcl-5基因，研究表明，正常bcl-6基因组全长26kb，具有l0个外显子，它编码一个含有706个氨基酸残基的蛋白质，分子量为92-98kd，属于一种转录抑制因子[3]。
1 实验材料和方法
1.1 材料 选取彭泽县人民医院病理科DLBCL存档蜡块53例，经2位副主任医师重新阅片，明确诊断并排除可能由惰性淋巴瘤转化为DLBCL的病例。存档蜡块全部重新制作HE切片，参照2008年WHO关于淋巴造血组织肿瘤分类标准，由两位副主任医师对其组织学和免疫表型进行回顾性分析并确诊。另选淋巴结反应性增生标本20例做对照组。
1.2 方法
1.2.1 DLBCL组织芯片的构建与制备
1)组织芯片模块制做：将熔化石蜡(加入等量的蜂蜡)制作成2.5×2×0.5大小的空白蜡块，设计制作受体蜡块。
2)组织芯片的设计和制备：将原蜡块放在45℃温箱中烘5-10min待蜡块变软，然后，先在显微镜下定位，避开出血坏死区，选取肿瘤组织丰富的区域，用穿刺针从组织块选定部位逐个取出组织芯，放入预先设计的阵列模块中，制成组织芯片。将制成的组织芯片面朝下放在铜板上，于55℃放置30min，轻压模块使组织柱在模块中排平。待冷却后放入72℃烤箱中，维持时间1小时，目的是使组织芯与受体蜡块充分融合。
3)组织芯片蜡块采用连续切片，切片厚度约4μm，用多聚赖氨酸处理过的玻片捞片，置37℃电热恒温箱中烤片过夜，以备实验用。
1.2.2 免疫组化结果判定 ：CD20、CD79a、CD3、CD10、Bcl-6、MUM-l用来帮助判断肿瘤细胞及明确诊断并进行GCB 和non-GCB分组；CD20、CD79a、CD3、CD10着色部位位于细胞膜，如果有大于30%以上的细胞出现阳性着色记为阳性； Bcl-6、MUMl为胞核着色，如果有大于30%以上的细胞出现阳性着色记为阳性。
1.2.3 FISH结果判断
bcl-6双色分离探针是在bcl-6基因的5’和3’端分别设计两个探针，分别标以红色和绿色荧光。bcl-6基因正常的细胞显示为2个红色和绿色荧光靠的很近或融合的信号；当bcl-6基因出现重排时，bcl-6之1个等位基因的5’和3’端分离，红色和绿色荧光信号分开，表现为两个分离的信号；另外一个等位基因未分离，表现为一个融合的黄色信号或两个靠的很近的红色和绿色信号。当多于20%的肿瘤细胞核，呈现红色和绿色荧光信号分开时，即确定有bcl-6基因重排。1.3统计处理
免疫组化结果采用百分率比较采用X2检验,当样本例数较少时，采用Fisher确切概率检验；蛋白表达的相关性采用Spearman相关检验，采用SPSS13.0软件进行统计学处理，以P<0.05为差别有统计学意义。
2 结果
2.1 bcl-6基因重排
对于掉片或信号图像不清晰的病例，另外补切片重做FISH。选择背景低、信号强、细胞轮廓清楚的肿瘤细胞计数。53例DLBCL患者中bcl-6基因重排12例(22.6%)，其中GCB型2例(16.7%)，non-GCB型10例(24.4%)。基因重排与临床特征的关系见(表1)，基因重排与DLBCL分组之间的关系见(表2)。
2.2 bcl-6基因重排与Bcl-6蛋白表达的关系
在有bcl-6基因重排的12例患者中，有3例表达Bcl-6蛋白，表达率为25%(3/12)。bcl-6基因重排与Bcl-6蛋白表达之间无统计学意义(P=1.000)。Bcl-6蛋白表达与bcl-6基因重排的关系见。
3 讨论
在本组试验中，bcl-6基因重排率为22.6%(12/53)，其中GCB组为16.7%(2/12)，non-GCB组为24.4(10/41)，两者之间无统计学意义。
西方人群DLBCL的bcl-6基因重排率为20-40%，中国内地和台湾人群小样本DLBCL的bcl-6基因重排率为17-30%，提示中国人群bcl-6基因重排率与国外相似。Jerkeman报道，用Southern blot方法检测44例冰冻标本中，6例发生bcl-6基因重排，重排率为14%，略低于本试验比例，而且提示bcl-6基因重排对预后没有影响。Niitsu 报道有23.1%(43/186)的DLBCL有bcl-6重排，与本试验的研究结果一致，其中有22例患者CD5阳性，阳性率为11.8%(22/186)，其中有7例bcl-6重排，阳性率为31.8%(7/22)。
在本试验中，结内有3例bcl-6基因重排，结外有9例bcl-6基因重排，结内和结外重排率无差异(P>0.05)。hOffit报道，结外比结内DLBCL有更多的bcl-6重排，且有bcl-6重排的患者比胚系患者有更好的预后。作者推测，有些以前的报道提示bcl-6重排与好的预后有关，其中原因之一是可能大多数病人是属于结外DLBCL，而这些病例尚处于早期阶段，病变比较局限，肿瘤体积小，所以预后好。但也有相反的报道，如Kramer报道，bcl-6重排在结内和结外断裂率没有区别，与本试验结果一致，而且作者提示是否重排对预后也没有影响。
Niitsu报道bcl-6最常见的易位类型为t(3;14)(q27;q32),易位对象为Ig重链基因(IgH)。IgH基因的断裂点位于可变区，IgH基因的上游序列与bcl-6并列。其它的易位为t(3;22)(q27;q21)、t(2;3)(p12;q27),易位对象分别为入轻链基因(IgL入)和k轻链基因(IgLk)。
在本试验中，在12例bcl-6基因重排的患者，有3例表达Bcl-6蛋白，表达率为25%，bcl-6基因重排与Bcl-6蛋白表达之间无之间相关性。Skinnider 报道，85%的有bcl-6基因异常的有bcl-6蛋白表达，比本试验的表达率高，但作者报道Bcl-6蛋白表达与bcl-6基因异常无关 ......
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