HPLC法测定黔产钩藤中钩藤碱及异钩藤碱含量
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【摘要】 目的：研究建立了黔产钩藤药材中钩藤碱与异钩藤碱的含量测定方法。方法：采用HPLC法：KromosilC18色谱柱( 250 mm × 4.6 mm，5μm)；流动相以甲醇-0.2%氨水溶液(65：35)，流速：1.0mL·min-1，柱温：35℃ ；进样器温度：5℃；检测波长为245 nm，结果：异钩藤碱和钩藤碱分别在0.130 64～1.175 76μg (r=1.000 0 )和0.097 44～0.876 96μg (r=0.999 8)范围内呈良好的线性关系。异钩藤碱平均回收率(n=6)为98.88% ，RSD为0.38%：钩藤碱平均回收率(n=6)为98.28% ，RSD为0.72% ；结论：本检测方法快速、简便、灵敏、准确、可靠，重复性好，为黔产钩藤药材的质量控制提供了科学依据。
【关键词】 黔产钩藤；HPLC 钩藤碱；异钩藤碱；含量测定
贵州道地药材钩藤,为茜草科茜草属钩藤的干燥带钩枝茎。作为常用的中药材之一，具有清热平肝，熄风定惊的作用。主要用于头痛眩晕、感冒夹惊、惊痫抽搐、妊娠子痫，以及高血压等症。现代研究表明，钩藤的主要有效成分是总生物碱，其中以钩藤碱与异钩藤碱为主，具有降血压、抗心律失常以及抗血小板聚集和抗血栓形成的作用，目前，随着医药科技的发展，由于钩藤的深入开发研究，钩藤的功能效用在不断扩大，己越来越受到人们关注。由于钩藤的临床应用极为广泛，现有较多的制剂使用钩藤作为主要原料药材。因此，利用钩藤制成的具有降血压、抗心律失常等治疗各种病症的复方制剂较多，如潜阳降压胶囊、天钩灵胶囊等，特别是进几年来利用钩藤提取制成的钩藤碱静脉注射液，具有抗脑血栓的作用。目前评价钩藤质量优劣的标准，多以钩藤碱和异钩藤碱的含量为指标。因此，我们采用合适、简便的方法提取钩藤中的钩藤碱与异钩藤碱，并采用快速、准确的RP-HPLC法测定其含量，有助于黔产钩藤药材的质量控制。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪；美国WaTers2996 Separatnms Madule photodiode Arroy Detebo 高效液相自动进样及分离系统;Waters 2996二极管阵列；检测器紫外检测器 Empowrer色谱数据工作战；KQ-500D A型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，实验所使用试剂试药均为分析纯。钩藤碱(纯度为98% )和异钩藤碱(纯度为98% )对照品购自上海原叶生物科技有限公司(批号2010923-2011)。所用钩藤药材均由贵州省昌昊中药发展有限公司提供(剑河、榕江、锦屏、黎菠等)不同产地。
2 方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性试验色谱柱：十八烷基键和硅胶为填冲剂； KromosilC18柱(4.6 mnl×250 mm，5 m)， 以甲醇-0.2%氨水溶液(65：35)为流动相； 流速：1.0mL·min-1；柱温：35℃ ：进样器温度：5℃ ；检测波长为245nm。钩藤碱及异钩藤碱的检测波长均为245nm；理论塔板数按钩藤碱和异钩藤碱，峰面积计算应不底于3000；进样量10。
2.2 对照品溶液的制备：精密称取钩藤碱和异钩藤碱对照品加甲醇制成每1mL含60μg和每1mL含80μg的混合溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备：取本品粉末(过3号筛)约0.3g，精密称定，加入氯仿:甲醇(5:1)的混合溶剂20mL，冰箱5℃放置过夜，加0.5mL氨水，低温超声40分钟，过滤，用氯仿:甲醇(5:1)的混合溶剂洗涤容器及滤渣，滤液置蒸发皿中，在65℃水浴上挥干，残渣加甲醇定容置3mL容量瓶中，摇匀，微孔滤膜过滤，既得。
2.4 线性关系考察：精密称取钩藤碱和异钩藤碱对照品适量加甲醇制成每1mL含0.056 46mg·mL-1的钩藤碱溶液。和每1mL含0.083 751mg·mL-1的异钩藤碱溶液。精密吸取上述混合对照品溶液2ul、6ul、10ul、14ul、18ul、按顺序进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，异钩藤碱和钩藤碱为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：异钩藤碱Y=2 042 275.693 9 X-1 710.228 1， r=1.000 0 结果表明异钩藤碱在 0.130 64~1.175 76μg进样量与峰面积的线性关系良好。钩藤碱Y=2 466 259.236 5X+13 438.500 0，r=0.999 8结果表明钩藤碱在 0.097 44~0.876 96μg进样量与峰面积的线性关系良好。
2.5 精密度实验：精密吸取同一浓度的混合对照品溶液，重复进样6次，每次10 μL，钩藤碱峰面积RSD为0.02%，精密度良好。异钩藤碱峰面积RSD为0.03%，密度良好。
2.6 稳定性实验：取供试品溶液 ，按0、2、4、8、12、24 h进样，每次进样10μL，异钩藤碱峰面积RSD为0.30%，钩藤碱峰面积RSD为0.31%，表明样品在24小时内稳定。
2.7 重复性实验：取榕江钩藤药材粉末(过3号筛)约0.3g精密称定，按样品测定方法，平行制备6份供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪测定，异钩藤碱含量平均值为0.063 07%；RSD为0.31%。钩藤碱含量平均值为0.043 45%；RSD为0.85%。重复性良好。
2.8 回收率考察实验：采用加样回收法，精密称取已知异钩藤碱质量分数为0.630 7mg/g,钩藤碱质量分数为0.434 5mg/g的样品6份，分别精密加入一定量的异钩藤碱和钩藤碱对照品溶液，按供试品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件测定,在同样色谱条件下测定。异钩藤碱平均回收率为98.88%，RSD为0.38%；钩藤碱平均回收率为98.28%，RSD为0.72%。该方法回收率良好结果见表1、表2
表1 黔产钩藤药材中异钩藤碱回收率
Table 1 The isorhynchophylline average recoveries in Guizhou uncaria medicine
表2黔产钩藤药材中钩藤碱回收率
Table 2 The rhynchophylline average recoveries in Guizhou uncaria medicine
2.9 样品测定：分别精密吸取供试品溶液，与异钩藤碱和钩藤碱混合对照品溶液各 10 μL，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，测定峰面积积分值，按外标法计算样品溶液中异钩藤碱和钩藤碱的总含量。
表3 不同产地黔产钩藤药材中异钩藤碱和钩藤碱总含量(n=3)
Table 3 The total content of rhynchophylline and isorhynchophylline in different origin Guizhou uncaria medicine(n=3)
3 讨论
本次实验在流动相选取时,曾尝试多种流动相组成的；如采用甲醇：水，不同比列0.01mol/L三乙胺水溶液 ......
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