羟qiao基红花黄色素A对鼠骨折端骨痂中主要细胞TLR4表达的影响
 |
| 第1页 |
参见附件(2219KB，2页)。
【摘要】目的：探讨羟基红花黄色素A对鼠骨折端主要细胞(成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞)Toll样受体4(TLR4)表达的影响。方法 SD大鼠股骨骨折对接后14天骨折端的骨痂，进行成骨细胞、内皮细胞的原代培养。实验分4组，即对照组、骨康泰灵组、羟基红花黄色素A高、低量组。应用RT-PCR及Western-blot方法检测TLR4 mRNA表达及蛋白含量。结果 羟基红花黄色素A高剂量组成骨细胞、内皮细胞)、巨噬细胞TLR4 mRNA和蛋白含量低于对照组(P<0.05)。结论：羟基红花黄色素A能降低成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞 TLR4mRNA和蛋白表达。
【关键词】羟基红花黄色素A；TLR4；骨折端骨痂
EFFECT OFSafflomin A on the expression of TLR4 in callus osteoblasts, endothelial cells,macrophages./ Lu Chenyong / Chines medicine hospital Dian bai County Guang dong province
【Abstract】ObjectiveTo study the effects OFSafflomin A on the expression of TLR4 in callus osteoblasts,endothelial cells(EC),macrophages(MC). MethodsNormal osteoblasts were obtained for primary cultured of callus .The cells were divided into control group, Safflomin A high dose group and Safflomin A low dose group. Total mRNA and protein content of each group were analyzed by RT-PCR and Western blot, respectively. ResultsThe expression of TLR4 mRNA and protein content of osteoblasts,endothelial cells,macrophages Safflomin A high does group were significantly lower than in control group(P<0.05).ConclusionSafflomin A could down-regulaate the the expression of TLR4 mRNA callus osteoblasts, endothelial cells, macrophages.
【Key words】Safflomin A; TLR4; callus
研究表明在细胞内TLR4 mRNA 表达过强可影响细胞的分化[1]。骨折后骨折端骨痂中成骨细胞的分化程度决定着新生骨的形成。羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A)是具有单查尔酮苷类结构的化合物，是红花药理功效的最有效水溶性部位，有活血抗凝作用[2]。笔者羟基红花黄色素A对骨折端骨痂的成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞表达进行了研究，报告如下。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1全自动四孔水浴式PCR仪器 型号:SF31-FS-91(辽宁沈阳)，垂直型电泳槽和湿式电转膜槽，电转膜仪(美国Bio-Rad 公司)，DF-C 型电泳仪。
1.1.2试药 羟基红花黄色素A(四川曼思特生物科技有限公司)；RT-PCR 相关试剂(美国Gibac bird 公司)；免疫印迹相关试剂(北京东方德教育科技有限公司)。
1.1.3动物SD大鼠，雌雄不限，体重250-300g.
1.2方法
1.2.1细胞培养 取SD大鼠股骨骨折对接后14天骨折端的骨痂，进行成骨细胞、内皮细胞的原代培养。于37℃、5%CO2培养箱培养细胞，细胞密度为1×109个?L-L。用DMAM完全培养基(10%FBS，10万IU?L-L青霉素、10万ug?L-L链霉素)培养巨噬细胞(RAW264.7)；2.2模型及分组实验分4组，即对照组(正常细胞培养，加入等数量的培养基，不加入任何药物)、骨康泰灵组(加入等数量的培养基3h，再加入骨康泰灵注射液1mg)、羟基红花黄色素A高剂量组(5mg)、低剂量组(1mg)。
1.2.2应用RT-PCR及Western-blot方法检测TLR4 mRNA表达及蛋白含量应用Ultraspec TM-II RNA分离系统(Biotecx Laboratories，INC)提取总RNA，逆转录成cDNA，进行PCR反应。RT-PCR按照Takara公司试剂盒说明书进行操作。主要细胞TLR4及GAPDH(内参对照)引物序列及片段长度为：TLR4(356 bp)： AAACTTGCCTTCAAAAC：CTGGC ACCTGAACTCATCAATGGTCA;GAPDH(695bp):GGGAAGCT
CATCGGCATGGCTTCTTGATGTCATCATACTTGGCAG。
1.2.3免疫印迹法弃取培养基，用冰PBS洗2次，加入细胞裂解液，在冰上静置10-20分，转移PBS管中，加入1/3体积的4×sample buffer， 煮沸10 min，超声粉粹，室温下12000 r·min-1离心10 min ，取上清液。SDS-PAGE电泳分离蛋白，一抗37℃ 2h ,TBS 冲洗3×15min,碱性磷酸酶标记2抗37℃ 1h ,TBS冲洗3×15min,NBT方法显色10min。扫描分析。
1.2.4 统计学处理 数据应用SPSS13.0统计软件处理，X±s表示。采用单因素方差分析，组间比较用LDS检验分析。显著性水平P<0.05。
2结果
2.1羟基红花黄色素A高剂量组成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞TLR4 mRNA和蛋白含量低于对照组(P<0.05)。见表1和表2。
表1 羟基红花黄色素A高剂量组成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞TLR4 mRNA表达
表2羟基红花黄色素A高剂量组成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞TLR4蛋白表达
2讨论
骨折后，因骨折本身及邻近软组织的血管断裂出血，在骨折部位形成 了血肿，血肿于伤后6-8小时即开始凝结成含有网状纤维素的血凝块。骨折断端因血循环 中断，逐渐发生坏死。随着红细胞的破坏，纤维蛋白的渗出，毛细血管的增全，成纤维细胞、吞噬细胞、异物巨细胞的侵入，血肿逐渐机化，肉芽组织再演变成纤维结缔组织，使骨折断端初步连接在一起，称为纤维性骨痂，约在骨折后2-3周内完成。研究表明，Toll样受体4(TLR4)表达影响骨折端主要细胞：成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞的分化。1997年Janeway等首次在人体分离出果蝇Toll的同系物,将其命名为TLR4 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2219KB，2页)。