贵州名牌产品前列舒乐颗粒淫羊藿苷HPLC含量测定研究
[摘要]目的 建立用高效液相色谱法测定前列舒乐颗粒中淫羊藿苷含量的方法。方法 采用Waters Cts柱，流动相为乙腈-水(24：76)，检测波长为270nm。结果 淫羊藿苷在0.0615～0.738μg范围内线性关系良好，平均回收率为98.02%，RSD=2.31%(n=6)。结论 结果表明该方法准确可靠，重现性好，结果稳定。
[关键词]高效液相色谱法；前列舒乐颗粒；淫羊藿苷；含量测定
[中图分类号]R286 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616(2016)11-41-03
前列舒乐颗粒收载于卫生部药品标准中药成方制剂第十二册，由淫羊藿、黄芪、蒲黄、车前草和川牛膝等五味药组成，具有补肾益气，化瘀通淋的功效。用于肾脾双虚，血瘀湿阻，气化不利所致的淋症、癃症，前列腺增生，慢性前列腺炎；面色晃白，神疲乏力，腰膝酸软，小腹坠胀，小便不爽，点滴不出，或尿频、尿急、尿道涩痛等症。原质量标准无含量测定项目。由于淫羊藿为方中主要药物，而淫羊藿苷为其主要的药理活性成分之一，本文参考有关文献，研究建立用HPLC法测定淫羊藿苷含量的方法，方法可靠，可更好地用于控制其质量。
1仪器与试药
岛津LC-20A高效液相色谱仪，LC-20AT输液泵，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样装置；SPD-20A紫外检测器；CBM-20A通讯集成器；LC-Solution色谱工作站。TCQ-250超声波清洗器(北京医疗设备二厂)。淫羊藿苷对照品(中检所，供含量测定用，批号：110737-200512)。前列舒乐颗粒样品(国药准字Z52020270)及缺淫羊藿的阴性样品由贵州关德兴宝芝林药业有限公司提供。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件和系统适用性实验
液相色谱柱：Waters，SunFireTM C18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(24：76)，检测波长：270nm，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，进样量：10μL。在该色谱条件下，淫羊藿苷的保留时间约为17.5min，阴性对照在淫羊藿苷位置处无干扰峰，说明处方中其他药味对测定结果无影响，样品中淫羊藿苷和其相近的其它峰分离完全(分离度>0.5)，理论板数以淫羊藿苷计不低于4000。色谱见图1。
2.2对照品溶液的制备
取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1mL含淫羊藿苷25μg的溶液，即得。
2.3供试品溶液的制备
取前列舒乐颗粒装量差异项下的内容物，研细、混匀，精密称取1g，精密加入70%甲醇20mL，称定重量，超声20min，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜0.45μm滤过，取续滤液，即得。
2.4阴性对照溶液的制备
取处方中缺淫羊藿的阴性对照样品，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
2.5线性关系考察
精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每lmL含淫羊藿苷0.0615mg的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1、3、5、7、9、12μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品进样量(X，μg)为横坐标，做线性回归，回归方程为Y=2.20×106X+4.46×103，r=0.9995，结果表明淫羊藿苷在0.0615～0.738μg范围内，线性关系良好。
2.6精密度试验
精密吸取淫羊藿苷对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，重复进样6次，测定其峰面积，结果其峰面积的RSD为0.22%，表明仪器精密度良好。
2.7稳定性试验
精密吸取10μL同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，12h按“2.1”项下色谱条件测定。结果，淫羊藿苷平均峰面积为279536，RSD为2.14%，表明供试液在12h内具备良好的稳定性。
2.8重复性试验
取同一批号前列舒乐颗粒6份，精密称定，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。结果淫羊藿苷平均含量为0.3232mg/g，RSD为2.23%，说明本法具有较好的重复性。
2.9加样回收率试验
分别精密称取6份已知含量(0 3232mg/g)的样品约0.5g，精密加入淫羊藿苷(0.01538mg/mL)对照品溶液10mL，再精密加入70%甲醇10mL，分别按上述“2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，见表1。
2.10样品含量测定
分别取前列舒乐颗粒(10批)适量，分别按上述“2.2”项下方法制备10批样品的供试品溶液，再分别精密吸取对照品溶液与10批供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，见表2。
3讨论
经过超声处理及加热回流两种方法的对比研究，发现两者提取效果基本一致，超声处理相对简单，故采用超声处理的前处理提取方法。
本研究分别试验了乙醇，70%乙醇，50%乙醇，甲醇，70%甲醇和50%甲醇共6种提取溶剂，试验结果表明，采用70%的乙醇作为提取溶剂的提取效率最高。对超声时间进行了比较，比较了10，20，30，40，60和90min，由实验得出，当提取20min时，即可将制剂中的淫羊藿苷提取完全，而且由实验得出，超声时间越长，杂质越多，造成分离困难，故选择超声处理20min即可。
文献报道淫羊藿苷的测定方法主要有二阶导数分光光度法、紫外分光光度法、高效薄层扫描法、高效液相色谱法和液质联用法。随着色谱技术的发展以及广泛应用，高效液相色谱法以其操作简便、快速、灵敏度高和重现性好得到了越来越多的应用，本文通过对提取方法的考察优化，建立了高效液相色谱法测定贵州名牌产品前列舒乐颗粒中淫羊藿苷含量的方法，经方法学表明该方法快速、准确、重现性好，很好地解决了一般中药成分含量测定中的干扰成分多、难以分离的问题，可作为一种很好的前列舒乐颗粒中淫羊藿苷的含量测定方法，并为前列舒乐颗粒质量标准的完善提供依据。, http://www.100md.com(郭婷 许乾丽 茅向军等)
[关键词]高效液相色谱法；前列舒乐颗粒；淫羊藿苷；含量测定
[中图分类号]R286 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616(2016)11-41-03
前列舒乐颗粒收载于卫生部药品标准中药成方制剂第十二册，由淫羊藿、黄芪、蒲黄、车前草和川牛膝等五味药组成，具有补肾益气，化瘀通淋的功效。用于肾脾双虚，血瘀湿阻，气化不利所致的淋症、癃症，前列腺增生，慢性前列腺炎；面色晃白，神疲乏力，腰膝酸软，小腹坠胀，小便不爽，点滴不出，或尿频、尿急、尿道涩痛等症。原质量标准无含量测定项目。由于淫羊藿为方中主要药物，而淫羊藿苷为其主要的药理活性成分之一，本文参考有关文献，研究建立用HPLC法测定淫羊藿苷含量的方法，方法可靠，可更好地用于控制其质量。
1仪器与试药
岛津LC-20A高效液相色谱仪，LC-20AT输液泵，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样装置；SPD-20A紫外检测器；CBM-20A通讯集成器；LC-Solution色谱工作站。TCQ-250超声波清洗器(北京医疗设备二厂)。淫羊藿苷对照品(中检所，供含量测定用，批号：110737-200512)。前列舒乐颗粒样品(国药准字Z52020270)及缺淫羊藿的阴性样品由贵州关德兴宝芝林药业有限公司提供。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件和系统适用性实验
液相色谱柱：Waters，SunFireTM C18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(24：76)，检测波长：270nm，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，进样量：10μL。在该色谱条件下，淫羊藿苷的保留时间约为17.5min，阴性对照在淫羊藿苷位置处无干扰峰，说明处方中其他药味对测定结果无影响，样品中淫羊藿苷和其相近的其它峰分离完全(分离度>0.5)，理论板数以淫羊藿苷计不低于4000。色谱见图1。
2.2对照品溶液的制备
取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1mL含淫羊藿苷25μg的溶液，即得。
2.3供试品溶液的制备
取前列舒乐颗粒装量差异项下的内容物，研细、混匀，精密称取1g，精密加入70%甲醇20mL，称定重量，超声20min，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜0.45μm滤过，取续滤液，即得。
2.4阴性对照溶液的制备
取处方中缺淫羊藿的阴性对照样品，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
2.5线性关系考察
精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每lmL含淫羊藿苷0.0615mg的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1、3、5、7、9、12μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品进样量(X，μg)为横坐标，做线性回归，回归方程为Y=2.20×106X+4.46×103，r=0.9995，结果表明淫羊藿苷在0.0615～0.738μg范围内，线性关系良好。
2.6精密度试验
精密吸取淫羊藿苷对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，重复进样6次，测定其峰面积，结果其峰面积的RSD为0.22%，表明仪器精密度良好。
2.7稳定性试验
精密吸取10μL同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，12h按“2.1”项下色谱条件测定。结果，淫羊藿苷平均峰面积为279536，RSD为2.14%，表明供试液在12h内具备良好的稳定性。
2.8重复性试验
取同一批号前列舒乐颗粒6份，精密称定，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。结果淫羊藿苷平均含量为0.3232mg/g，RSD为2.23%，说明本法具有较好的重复性。
2.9加样回收率试验
分别精密称取6份已知含量(0 3232mg/g)的样品约0.5g，精密加入淫羊藿苷(0.01538mg/mL)对照品溶液10mL，再精密加入70%甲醇10mL，分别按上述“2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，见表1。
2.10样品含量测定
分别取前列舒乐颗粒(10批)适量，分别按上述“2.2”项下方法制备10批样品的供试品溶液，再分别精密吸取对照品溶液与10批供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，见表2。
3讨论
经过超声处理及加热回流两种方法的对比研究，发现两者提取效果基本一致，超声处理相对简单，故采用超声处理的前处理提取方法。
本研究分别试验了乙醇，70%乙醇，50%乙醇，甲醇，70%甲醇和50%甲醇共6种提取溶剂，试验结果表明，采用70%的乙醇作为提取溶剂的提取效率最高。对超声时间进行了比较，比较了10，20，30，40，60和90min，由实验得出，当提取20min时，即可将制剂中的淫羊藿苷提取完全，而且由实验得出，超声时间越长，杂质越多，造成分离困难，故选择超声处理20min即可。
文献报道淫羊藿苷的测定方法主要有二阶导数分光光度法、紫外分光光度法、高效薄层扫描法、高效液相色谱法和液质联用法。随着色谱技术的发展以及广泛应用，高效液相色谱法以其操作简便、快速、灵敏度高和重现性好得到了越来越多的应用，本文通过对提取方法的考察优化，建立了高效液相色谱法测定贵州名牌产品前列舒乐颗粒中淫羊藿苷含量的方法，经方法学表明该方法快速、准确、重现性好，很好地解决了一般中药成分含量测定中的干扰成分多、难以分离的问题，可作为一种很好的前列舒乐颗粒中淫羊藿苷的含量测定方法，并为前列舒乐颗粒质量标准的完善提供依据。, http://www.100md.com(郭婷 许乾丽 茅向军等)