祛风散寒除湿中药正清风痛宁缓释片对小鼠软骨细胞TGF—β、IL—1β、Fstl—1、TIMP—3表达水平的影响(3)
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参见附件。
2.2 总RNA的提取及逆转录 采用TRIzon Reagent提取软骨细胞总RNA，紫外分光光度计测定OD260/OD280定量。以qRT-PCR的M-MLV第一链合成系统反转录合成cDNA，所有操作均严格按照说明书进行，将所建立的20 μL反应体系冻存于-20 ℃冰箱以备使用。
2.3 实时定量PCR TGF-β、IL-1β、Fstl-1、TIMP-3及内参GAPDH的引物如表1所示，引物由invitrogen生物技术有限公司合成。将cDNA量稀释至2 ng。在50 μL反应体系中依次加入2×带有ROX的Plantinum SYBR Green qPCR Supermix-
UDG 25 μL，10 μm的上下游引物各1 μL，cDNA 5 μL，DEPC处理水18 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火，延伸30 s，45个循环。熔解曲线程序采用仪器默认设置。每个组设置3个复孔。
2.4 结果计算 以管家基因GAPDH作为内参基因，同时以空白对照组mRNA表达水平作为校准样本进行分析。计算3个复孔的平均CT值，根据目的基因的表达水平=2-△△CT计算表达结果。
2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 细胞活力检测 台盼蓝染色，细胞存活率为98.44%。
3.2 软骨细胞培养观察 原代培养24 h内，细胞呈球状悬浮状态，见图1(1) ......
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