高效液相色谱法检测治伤胶囊设备表面关附甲素的清洁残留
【摘要】目的：建立测定治伤胶囊生产设备表面关附甲素的清洁残留的方法。方法：色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C8柱(4.6mm*250mm，3.5μm)，流动相：0.2%庚烷磺酸钠缓冲液(加入0.2%三乙胺，磷酸调节至pH3)-乙腈(梯度洗脱)，流速：0.5ml/min；检测波长：205nm；柱温25℃。结果：盐酸关附甲素质量浓度在0.02mg/ml-0.16mg/ml的范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999)，其平均加样回收率(n=9)为101.4%。结论：本方法分离度和重复性良好，简单易行，可用于治伤胶囊设备表面关附甲素清洁残留的检测。
【关键词】高效液相色谱法；关白附；盐酸关附甲素；擦拭法；清洁残留
【中图分类号】R746.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851(2017)12--01
清洁验证是为了确定在中药生产过程中，设备、容器清洗后相关操作规程的可行性和有效性，清洁验证检测方法是衡量其清洁操作后是否符合规定的重要手段，公司主要产品治伤胶囊为复方制剂，处方有关白附、白芷、制南星和防风组成，其中关白附为生品毒性药材，从中药使用安全性考虑，选择关白附作为目标残留物，基于关附甲素最大日允许携带量为1.727mg/Kg，与关白附共用设备的与药品接触的总的表面积，，结合批量，以单位面积设备表面关附甲素残留限度为0.139 mg/100cm2。
1 材料与仪器
高效液相色谱仪、电子天平、酸度计、庚烷磺酸钠、盐酸关附甲素对照品、治伤胶囊等。
2 检验方法与结果
2.1 色谱条件：
色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C8柱(4.6mm*250mm，3.5μm) 流动相B：乙腈。
流动相A：0.2%庚烷磺酸钠缓冲液(加入0.2%三乙胺，磷酸调节至pH3)
流速：0.5ml/min；檢测波长：205nm；柱温25℃；进样量10μl。
2.2 对照品溶液的制备：
精密称取盐酸关附甲素对照品，用流动相A溶解并稀释，制成80?g/ml的溶液。
2.3 供试品溶液的制备：
取治伤胶囊内容物约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1%盐酸溶液50ml，称重，超声处理(功率300W，频率50kHz)30分钟(水温50℃以下)，放冷，加入1%盐酸溶液补足失重，摇匀，移取上清液，过0.45μm微孔滤膜。
2.4 供试品擦拭样制备：
取治伤胶囊粉末约0.1g均匀涂布在面积约为100 cm2的不锈钢板上，待涂匀后，用干净的棉球(用纯化水浸润)将不锈钢板擦拭干净，然后将棉球浸在10ml1%盐酸溶液中，超声处理(功率300W，频率50kHz)30分钟(水温50℃以下)，放冷，摇匀，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得。
2.5 系统适用性
按2.1项下的色谱条件，取2.3项下供试品溶液，测得理论板数按盐酸关附甲素峰计不低于10000，与其相邻色谱峰分离度大于1.5。
2.6 方法学考察
2.6.1 线性关系考察。
精密量取盐酸关附甲素对照品储备液(0.8mg/ml)0.3、0.5、0.7、1.0、1.2、1.5、2.0ml分别至10ml容量瓶中用流动相A稀释至刻度，制成系列标准溶液，进样，记录图谱。以峰面积(A)为纵坐标，质量浓度(C)为横坐标进行回归计算，得回归方程A=11367C+28.96(r=0.9999)。其质量浓度范围为：0.0199mg/ml-1.591mg/ml。
2.6.2 重复性试验。精密称取同一批治伤胶囊内容物，按2.3处理，制成6份供试品溶液，进样，记录色谱图。测得结果6份样品的盐酸关附甲素含量的RSD(n=6)为3%。表明该方法的重复性良好。
2.6.3 回收率试验。取3个10ml量瓶，加入浓度约为0.4mg/ml盐酸关附甲素溶液0.5ml及治伤胶囊内容物85mg；取3个10ml量瓶，加入浓度约为0.4mg/ml盐酸关附甲素溶液1.0ml及治伤胶囊内容物171mg；取3个10ml量瓶，加入浓度约为0.4mg/ml盐酸关附甲素溶液1.5ml及治伤胶囊内容260mg。9个样均按2.3处理，进样，记录色谱图。结果50%的回收率为101.2%，100%的回收率为102.3%，150%的回收率为100.8%平均加样回收率为101.4%，RSD(n=9)为0.9%。
2.6.4 擦拭回收率。50%浓度(约0.04mg/ml)：取治伤胶囊内容物约195mg，按2.4方法制备三份；100%浓度(约0.08mg/ml)：取治伤胶囊内容物约390mg，同法制备；150%浓度(约0.12mg/ml)：取治伤胶囊内容物约585mg，同法制备。结果测得：50%的质量浓度，擦拭回收率为86.9%；100%的擦拭回收率为86.8%；150%的擦拭回收率为86.9%。RSD(n=9)为3%。该擦拭方法可将残留在设备表面的大部分药粉擦拭下来。
2.6.5 生产车间设备清洁后，擦拭取样，按2.4制备供试品溶液。结果未检出盐酸关附甲素的残留。
3 讨论
该方法为中药治伤胶囊中毒性药材的残留提供了可靠的方法，此方法的建立，解决了公司中药产品清洁残留的问题。关白附、治伤胶囊含量测定一直采用传统的滴定方法，而且以生物碱关附甲素计算含量，缺少毒性药材中毒性物质的定量检测，据文献[1]记载，关白附中毒性成分主要有关附甲素、关附壬素和关附辛素，其中关附辛素的毒性最高，能抑制骨骼肌系统和呼吸系统，而且含量较高，如何采用有效的方法来定量控制关白附中所含的毒性物质，需要我们采用灵敏度更高、方法简单易行的高效液相来解决，这也势必是日后中药材鉴别和有效成分含量测定的趋势。
本文所建立的方法分离度和重复性良好，简单易行，可用于治伤胶囊设备表面关附甲素清洁残留的检测，同时该方法也可用于测定治伤胶囊或关白附的含量。
参考文献
RP-HPLC法同时测定中药关白附中关附甲素、关附壬素和关附辛素含量；药学进展；2011，35(5)：230-233。, 百拇医药(徐凯 戚兰君 张群)
【关键词】高效液相色谱法；关白附；盐酸关附甲素；擦拭法；清洁残留
【中图分类号】R746.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851(2017)12--01
清洁验证是为了确定在中药生产过程中，设备、容器清洗后相关操作规程的可行性和有效性，清洁验证检测方法是衡量其清洁操作后是否符合规定的重要手段，公司主要产品治伤胶囊为复方制剂，处方有关白附、白芷、制南星和防风组成，其中关白附为生品毒性药材，从中药使用安全性考虑，选择关白附作为目标残留物，基于关附甲素最大日允许携带量为1.727mg/Kg，与关白附共用设备的与药品接触的总的表面积，，结合批量，以单位面积设备表面关附甲素残留限度为0.139 mg/100cm2。
1 材料与仪器
高效液相色谱仪、电子天平、酸度计、庚烷磺酸钠、盐酸关附甲素对照品、治伤胶囊等。
2 检验方法与结果
2.1 色谱条件：
色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C8柱(4.6mm*250mm，3.5μm) 流动相B：乙腈。
流动相A：0.2%庚烷磺酸钠缓冲液(加入0.2%三乙胺，磷酸调节至pH3)
流速：0.5ml/min；檢测波长：205nm；柱温25℃；进样量10μl。
2.2 对照品溶液的制备：
精密称取盐酸关附甲素对照品，用流动相A溶解并稀释，制成80?g/ml的溶液。
2.3 供试品溶液的制备：
取治伤胶囊内容物约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1%盐酸溶液50ml，称重，超声处理(功率300W，频率50kHz)30分钟(水温50℃以下)，放冷，加入1%盐酸溶液补足失重，摇匀，移取上清液，过0.45μm微孔滤膜。
2.4 供试品擦拭样制备：
取治伤胶囊粉末约0.1g均匀涂布在面积约为100 cm2的不锈钢板上，待涂匀后，用干净的棉球(用纯化水浸润)将不锈钢板擦拭干净，然后将棉球浸在10ml1%盐酸溶液中，超声处理(功率300W，频率50kHz)30分钟(水温50℃以下)，放冷，摇匀，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得。
2.5 系统适用性
按2.1项下的色谱条件，取2.3项下供试品溶液，测得理论板数按盐酸关附甲素峰计不低于10000，与其相邻色谱峰分离度大于1.5。
2.6 方法学考察
2.6.1 线性关系考察。
精密量取盐酸关附甲素对照品储备液(0.8mg/ml)0.3、0.5、0.7、1.0、1.2、1.5、2.0ml分别至10ml容量瓶中用流动相A稀释至刻度，制成系列标准溶液，进样，记录图谱。以峰面积(A)为纵坐标，质量浓度(C)为横坐标进行回归计算，得回归方程A=11367C+28.96(r=0.9999)。其质量浓度范围为：0.0199mg/ml-1.591mg/ml。
2.6.2 重复性试验。精密称取同一批治伤胶囊内容物，按2.3处理，制成6份供试品溶液，进样，记录色谱图。测得结果6份样品的盐酸关附甲素含量的RSD(n=6)为3%。表明该方法的重复性良好。
2.6.3 回收率试验。取3个10ml量瓶，加入浓度约为0.4mg/ml盐酸关附甲素溶液0.5ml及治伤胶囊内容物85mg；取3个10ml量瓶，加入浓度约为0.4mg/ml盐酸关附甲素溶液1.0ml及治伤胶囊内容物171mg；取3个10ml量瓶，加入浓度约为0.4mg/ml盐酸关附甲素溶液1.5ml及治伤胶囊内容260mg。9个样均按2.3处理，进样，记录色谱图。结果50%的回收率为101.2%，100%的回收率为102.3%，150%的回收率为100.8%平均加样回收率为101.4%，RSD(n=9)为0.9%。
2.6.4 擦拭回收率。50%浓度(约0.04mg/ml)：取治伤胶囊内容物约195mg，按2.4方法制备三份；100%浓度(约0.08mg/ml)：取治伤胶囊内容物约390mg，同法制备；150%浓度(约0.12mg/ml)：取治伤胶囊内容物约585mg，同法制备。结果测得：50%的质量浓度，擦拭回收率为86.9%；100%的擦拭回收率为86.8%；150%的擦拭回收率为86.9%。RSD(n=9)为3%。该擦拭方法可将残留在设备表面的大部分药粉擦拭下来。
2.6.5 生产车间设备清洁后，擦拭取样，按2.4制备供试品溶液。结果未检出盐酸关附甲素的残留。
3 讨论
该方法为中药治伤胶囊中毒性药材的残留提供了可靠的方法，此方法的建立，解决了公司中药产品清洁残留的问题。关白附、治伤胶囊含量测定一直采用传统的滴定方法，而且以生物碱关附甲素计算含量，缺少毒性药材中毒性物质的定量检测，据文献[1]记载，关白附中毒性成分主要有关附甲素、关附壬素和关附辛素，其中关附辛素的毒性最高，能抑制骨骼肌系统和呼吸系统，而且含量较高，如何采用有效的方法来定量控制关白附中所含的毒性物质，需要我们采用灵敏度更高、方法简单易行的高效液相来解决，这也势必是日后中药材鉴别和有效成分含量测定的趋势。
本文所建立的方法分离度和重复性良好，简单易行，可用于治伤胶囊设备表面关附甲素清洁残留的检测，同时该方法也可用于测定治伤胶囊或关白附的含量。
参考文献
RP-HPLC法同时测定中药关白附中关附甲素、关附壬素和关附辛素含量；药学进展；2011，35(5)：230-233。, 百拇医药(徐凯 戚兰君 张群)