基于SSR分子标记的药用黄芪遗传多样性与遗传结构分析
【摘要】目的：探讨基于简单重复序列(SSR)分子标记的药用黄芪遗传多样性与遗传结构研究开展价值。方法：收集来自不同产地的400份药用黄芪样本，其中90份膜荚黄芪，310份蒙古黄芪，均施以遗传多样性与结构分析。结果：1、膜荚黄芪与蒙古黄芪均有较高遗传多样性，且蒙古黄芪遗传多樣性高于膜荚黄芪。2、药用黄芪遗传变异主要发生于居群内。根据黄芪居群遗传结构分析，可把黄芪不同居群分成3个亚群，其中，膜荚黄芪为1亚群，内蒙古区与少数山西居群为1亚群，多数山西产地居群为1亚群。结论：在SSR标记基础上实施药用黄芪多样性与遗传结构分析的开展，可有效了解药用黄芪遗传特点，从而为药用黄芪育种、利用、研发优质黄芪资源提供参考。
【关键词】药用黄芪;遗传结构;遗传多样性
【中图分类号】 R567.239
【文献标识码】A
【文章编号】2095-6851(2020)08-098-02
黄芪又名绵芪，具有抗衰老、抗应激、利尿、保肝、降压、抗菌等作用，多见于陕西、黑龙江、甘肃、山西、内蒙古等地。黄芪属中医方剂内常用补气药物，常被用于表虚自汗、阴虚盗汗、肺气虚证等治疗中，目前已有2000多年的药用历史[1]。现阶段，黄芪不再仅限于药物治疗中，逐渐开始被人们用于食疗与保健中。但由于黄芪资源需求的增大，导致近年来野生黄芪资源几乎枯竭，人工培养黄芪已成市场潮流。但人工培养黄芪种质较为混杂，生产水平较低，易造成用药疗效不佳。因此，需规范黄芪人工育种。鉴于此，药用黄芪遗传多样性与遗传结构分析研究的开展十分必要，其能帮助人们掌握黄芪遗传多样性、变异程度与居群构成，从而为黄芪育种提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
收集400份药用黄芪，其中90份膜荚黄芪，310份蒙古黄芪，包括吉林、辽宁、黑龙江、山西、蒙古5个省份22个自然居群。
1.2 方法
基因组DNA提取：以十六烷基三甲基溴化铵法分别提取每个样本基因组DNA，通过核酸蛋白检测仪，利用琼脂糖凝胶电泳法，检测所提取DNA浓度，将最终DNA浓度调成50ng/ul，放于-20℃条件下备用。
PCR扩增与检测：参照SSR通用性特点，以同科植物甘草64对SSR引物，实施多态性筛选，选取10对重复性、多态性较高的SSR引物进行试验。PCR扩增体系结合以往研究进行，以全自动毛细管电泳检测扩增产物。
SSR数据处理：判定并记录毛细管电泳检查结果，以PowerMarker软件处理SSR位点多态信息值(PIC)，通过GenAIEx6.503软件分析遗传分化与遗传多样性，包括：有效等位基因(Ne)、等位基因数(Na)、遗传多样性(H)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)。
2 结果
2.1 药用黄芪遗传多样性分析
基于物种层次上，对膜荚黄芪与蒙古黄芪实施遗传多样性分析(表2)，发现膜荚黄芪、蒙古黄芪H分别为0.756、0.807，平均为0.781，总体而言以上两种黄芪遗传多样性均较高，其中，膜荚黄芪遗传多样性低于蒙古黄芪。两种黄芪的居群观测杂合度皆低于期望杂合度，并F均高于零，这提示两种黄芪居群有杂合子缺陷。
2.2 药用黄芪遗传结构分析
通过GenAlEx6.503软件，对膜荚黄芪、蒙古黄芪居群内、居群间遗传变异实施分子方差分析(表3)，发现黄芪居群内遗传变异率为84%，居群间遗传变异率为6%，种间遗传变异率为8%，这表示遗传变异主要存在于居群内。以STRUCTURE软件对黄芪居群遗传结构进行分析，把分组数K设置为2～10，每个K值反复测试10次，结果显示，△K到达最大值时，K为3，故而可把黄芪22个居群分成3个亚群，即膜荚黄芪为1个亚群，内蒙古区与少数山西居群为1亚群，多数山西产地居群为1亚群。
3 讨论
近年来，由于分子标记技术的快速发展，临床上已将多种分子标记用于遗传图谱组建、核心种质构建、亲缘关系鉴定、植物遗传多样性分析等中[2]。SSR属于共显性标记，由于其具有多态性高、重复性好、操作便利等优势，目前已成为最有效、理想的一种分子标记，并被广泛用于党参、甘草等多种药物遗传多样性分析中[3]。故而，本研究中以SSR分子标记来分析不同产地的药用黄芪遗传多样性与遗传结构，掌握不同物种不同居群药用黄芪遗传特点、变异情况与居群结构，以期为黄芪优质育种与保护工作提供理论支持。
本研究中，经对400个样本遗传多样性分析，得出药用黄芪具有较好遗传多样性，其中蒙古黄芪遗传多样性更丰富，这表示蒙古黄芪在不断生长与进化中，累积了多种等位变异基因，较膜荚黄芪，其环境适应能力更强，遗传进化更有潜力。膜荚黄芪与蒙古黄芪居群间、物种间的分子方差分析结果提示：以上两种黄芪遗传变异主要存在于居群内。膜荚黄芪与蒙古黄芪均属于异花授粉植物，此特点促使黄芪于生长繁殖期间居群内部更易发生基因交流与变异，所以，这可能为黄芪变异主要存在于居群内的原因。黄芪居群遗传结构分析结果显示：膜荚黄芪为1亚群，蒙古黄芪分为2个亚群，一个为内蒙古区与一些山西居群，1个为多数山西产地居群，这可能是由于内蒙古地区与山西地区均为药用黄芪主要生产地，因人为因素导致两地区黄芪出现种质交流;加之两地地理环境较为相似，生长期间可能会出现变异与同等分化。
综上，药用黄芪遗传多样性与遗传结构分析的开展，能帮助人们了解黄芪遗传多样性、变异特点与居群构成，有助于黄芪优质育种、利用、开发工作的开展。
参考文献：
[1] 刘蓬蓬，陈江宁，孟莉，等. 基于Illumina MiSeq高通量测序分析黄芪内生细菌多样性[J]. 中草药，2018，49(11)：214-216.
[2] 王刚，曹佩. 分子标记技术在药用植物种质资源研究中的应用[J]. 中国现代中药，2019，21(11)：1435-1444.
[3] 杨育峰，史典义，王雁楠，等. 基于转录组测序数据的甘薯SSR标记开发及群体聚类分析[J]. 分子植物育种，2018，23(11)：3569-3579., 百拇医药(奚华英)
【关键词】药用黄芪;遗传结构;遗传多样性
【中图分类号】 R567.239
【文献标识码】A
【文章编号】2095-6851(2020)08-098-02
黄芪又名绵芪，具有抗衰老、抗应激、利尿、保肝、降压、抗菌等作用，多见于陕西、黑龙江、甘肃、山西、内蒙古等地。黄芪属中医方剂内常用补气药物，常被用于表虚自汗、阴虚盗汗、肺气虚证等治疗中，目前已有2000多年的药用历史[1]。现阶段，黄芪不再仅限于药物治疗中，逐渐开始被人们用于食疗与保健中。但由于黄芪资源需求的增大，导致近年来野生黄芪资源几乎枯竭，人工培养黄芪已成市场潮流。但人工培养黄芪种质较为混杂，生产水平较低，易造成用药疗效不佳。因此，需规范黄芪人工育种。鉴于此，药用黄芪遗传多样性与遗传结构分析研究的开展十分必要，其能帮助人们掌握黄芪遗传多样性、变异程度与居群构成，从而为黄芪育种提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
收集400份药用黄芪，其中90份膜荚黄芪，310份蒙古黄芪，包括吉林、辽宁、黑龙江、山西、蒙古5个省份22个自然居群。
1.2 方法
基因组DNA提取：以十六烷基三甲基溴化铵法分别提取每个样本基因组DNA，通过核酸蛋白检测仪，利用琼脂糖凝胶电泳法，检测所提取DNA浓度，将最终DNA浓度调成50ng/ul，放于-20℃条件下备用。
PCR扩增与检测：参照SSR通用性特点，以同科植物甘草64对SSR引物，实施多态性筛选，选取10对重复性、多态性较高的SSR引物进行试验。PCR扩增体系结合以往研究进行，以全自动毛细管电泳检测扩增产物。
SSR数据处理：判定并记录毛细管电泳检查结果，以PowerMarker软件处理SSR位点多态信息值(PIC)，通过GenAIEx6.503软件分析遗传分化与遗传多样性，包括：有效等位基因(Ne)、等位基因数(Na)、遗传多样性(H)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)。
2 结果
2.1 药用黄芪遗传多样性分析
基于物种层次上，对膜荚黄芪与蒙古黄芪实施遗传多样性分析(表2)，发现膜荚黄芪、蒙古黄芪H分别为0.756、0.807，平均为0.781，总体而言以上两种黄芪遗传多样性均较高，其中，膜荚黄芪遗传多样性低于蒙古黄芪。两种黄芪的居群观测杂合度皆低于期望杂合度，并F均高于零，这提示两种黄芪居群有杂合子缺陷。
2.2 药用黄芪遗传结构分析
通过GenAlEx6.503软件，对膜荚黄芪、蒙古黄芪居群内、居群间遗传变异实施分子方差分析(表3)，发现黄芪居群内遗传变异率为84%，居群间遗传变异率为6%，种间遗传变异率为8%，这表示遗传变异主要存在于居群内。以STRUCTURE软件对黄芪居群遗传结构进行分析，把分组数K设置为2～10，每个K值反复测试10次，结果显示，△K到达最大值时，K为3，故而可把黄芪22个居群分成3个亚群，即膜荚黄芪为1个亚群，内蒙古区与少数山西居群为1亚群，多数山西产地居群为1亚群。
3 讨论
近年来，由于分子标记技术的快速发展，临床上已将多种分子标记用于遗传图谱组建、核心种质构建、亲缘关系鉴定、植物遗传多样性分析等中[2]。SSR属于共显性标记，由于其具有多态性高、重复性好、操作便利等优势，目前已成为最有效、理想的一种分子标记，并被广泛用于党参、甘草等多种药物遗传多样性分析中[3]。故而，本研究中以SSR分子标记来分析不同产地的药用黄芪遗传多样性与遗传结构，掌握不同物种不同居群药用黄芪遗传特点、变异情况与居群结构，以期为黄芪优质育种与保护工作提供理论支持。
本研究中，经对400个样本遗传多样性分析，得出药用黄芪具有较好遗传多样性，其中蒙古黄芪遗传多样性更丰富，这表示蒙古黄芪在不断生长与进化中，累积了多种等位变异基因，较膜荚黄芪，其环境适应能力更强，遗传进化更有潜力。膜荚黄芪与蒙古黄芪居群间、物种间的分子方差分析结果提示：以上两种黄芪遗传变异主要存在于居群内。膜荚黄芪与蒙古黄芪均属于异花授粉植物，此特点促使黄芪于生长繁殖期间居群内部更易发生基因交流与变异，所以，这可能为黄芪变异主要存在于居群内的原因。黄芪居群遗传结构分析结果显示：膜荚黄芪为1亚群，蒙古黄芪分为2个亚群，一个为内蒙古区与一些山西居群，1个为多数山西产地居群，这可能是由于内蒙古地区与山西地区均为药用黄芪主要生产地，因人为因素导致两地区黄芪出现种质交流;加之两地地理环境较为相似，生长期间可能会出现变异与同等分化。
综上，药用黄芪遗传多样性与遗传结构分析的开展，能帮助人们了解黄芪遗传多样性、变异特点与居群构成，有助于黄芪优质育种、利用、开发工作的开展。
参考文献：
[1] 刘蓬蓬，陈江宁，孟莉，等. 基于Illumina MiSeq高通量测序分析黄芪内生细菌多样性[J]. 中草药，2018，49(11)：214-216.
[2] 王刚，曹佩. 分子标记技术在药用植物种质资源研究中的应用[J]. 中国现代中药，2019，21(11)：1435-1444.
[3] 杨育峰，史典义，王雁楠，等. 基于转录组测序数据的甘薯SSR标记开发及群体聚类分析[J]. 分子植物育种，2018，23(11)：3569-3579., 百拇医药(奚华英)