旷文安，黄伟聪，王珏，杨凯，郑哲，孙成超

    (1.温州医学院附属第一医院 心胸外科，浙江 温州 325000；2.北京阜外心血管病医院 卫生部再生医学重点实验室，北京 100037)

    最新的实验研究表明，哺乳动物心脏在出生后早期存在心肌细胞的分裂增殖[1]，而对于成熟的心肌细胞，在特定的条件下仍然可以被诱导重新进入细胞周期，并以增生性生长为主的方式改善心脏功能[2]。心肌细胞的增殖依赖于心肌细胞的有丝分裂，Ccnd1、Ccna2、Ccnb1、Cdc2、CDk2、Cdk4、Cdkn1a和Cdkn1b等细胞周期进程相关基因的表达与心肌细胞的有丝分裂密切相关[3-4]。组蛋白H3的磷酸化贯穿于有丝分裂分裂期(M期)的各个时相[5]，是目前标记细胞有丝分裂的最佳指标之一，且广泛用于心肌细胞的增殖研究中[1，6]。本实验应用RT-PCR的方法定量检测细胞周期相关基因在大鼠出生后早期不同时间点的表达情况，并以磷酸化组蛋白3(H3p)和肌钙蛋白T(cTnt)双重免疫荧光染色各时间点的心室肌组织，检测其有丝分裂指数，在细胞和组织水平共同研究大鼠出生后早期心肌细胞的增殖情况。

    1 材料和方法

    1.1 实验动物 出生后第1、4、7、10、14天的SD大鼠由温州医学院实验动物中心提供，研究经温州医学院实验动物伦理委员会批准。

    1.2 主要试剂 DMEM培养基、PBS、青链双抗、胰蛋白酶(北京四环生物有限公司)，胎牛血清FBS(美国Gibco公司)，H3p小鼠IgG单克隆抗体(美国millipore公司)，cTnt抗体(英国Abcam公司)，DAPI染色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)，逆转录试剂盒PromegaA3500(美国Promega公司)，引物设计与合成(北京六合通生物技术公司)：Gapdh(F：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，R：5’-ATGGTGG TGAAGACGCCAGTA-3’)；Ccnd1(F：5’-TACCGCACAACGCA CTTTC-3’，R：5’-AAGGGCTTCAATCTGTTCCTG-3’)；Ccna2(F：5’-GCCATCGCTTATTGCTGGAG-3’，R：5’-CTTTGAGGTAGGTCTGGTGAAGGTC-3’)；Ccnb1(F：5’-GGTGGAACTGGATGAGCCTGA-3’，R：5’-TGTTTCCATTGGGC TTGGAGA-3’)；Cdk1(F：5’-TCCCTGCAGGACTACAAGAA CAC-3’ ......