朱融和，陈慧瑶，庄强，江松福

    (温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015，1.儿科；2.血液内科)

    人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达

    朱融和1，陈慧瑶2，庄强2，江松福2

    (温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015，1.儿科；2.血液内科)

    目的：构建人肠三叶因子(hITF)重组真核表达载体，并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法：通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段，将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr，得到重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr；经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞，通过G418筛选，建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系；用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr，并建立了稳定转染的CHO细胞系，成功地表达了目的基因。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr，并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白，为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。

    人肠三叶因子；真核表达载体；CHO/dhfr-细胞

    人肠三叶因子(human intestinal trefoil factor，hITF)属于三叶因子家族中的一员，由59个氨基酸残基构成，其中含有6个高度保守的半胱氨酸序列，形成3对二硫键，从而产生特异而稳定的三叶草结构，这种稳定的结构，使其不受消化酶及pH值的影响，确保在胃肠道中发挥作用。体内外实验[1-3]证实，hITF是一种重要的胃肠黏膜保护因子，其作用可能是通过与黏液糖蛋白形成稳定的凝胶层复合物，保证了肠道屏障的完整性。目前多采用基因重组的方法获得hITF。国内报道[4]在大肠杆菌中表达出重组hITF，表达量为3～4 mg/L，但缺乏必要的折叠、修饰等后期加工，蛋白活性大大降低。本研究通过构建重组真核表达载体，转染CHO/ dhfr-细胞，G418筛选获得稳定表达细胞克隆，并对表达产物进行鉴定，为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。

    1 材料和方法

    1.1材料

    1.1.1质粒、菌体及细胞系：真核表达载体pIRES/dhfr由复旦大学遗传所陶建军博士赠送；hITF的克隆质粒pSG5-hITF由法国Catherine Tomasetto教授赠送；大肠杆菌DH5α由本实验室保存；CHO/dhfr-细胞购自中国科学院上海生科院细胞库 ......