结核分枝杆菌pst S1基因的扩增及生物信息学分析
摘要： 目的 扩增编码结核分枝杆菌分泌蛋白的pst S1基因，运用生物信息学方法和软件预测其编码蛋白的生物学特征，为早期结核病的诊断以及新的抗结核药物的研制奠定基础。方法 采用聚合酶链反应扩增出pst S1基因，对其核苷酸序列进行测定；利用序列对比分析和蛋白质结构预测软件进行生物信息学分析和模拟。结果 获得的pst S1基因的全长1112bp，基因序列与Genbank公布的标准株的基因序列的核苷酸同源性为92.6%，初步预测出该蛋白的分子特征、抗原性和二级结构。结论 成功扩增MTB的pst S1基因，通过生物信息学分析获得了该蛋白的信息特征，为进一步研究其生物学功能和免疫学活性奠定了基础。
关键词：结核分枝杆菌；pst S1基因；扩增；生物信息学
结核病(Tuberculosis， TB )是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis， MTB)所致的、以呼吸系统感染为主的慢性传染病。世界卫生组织全球结核病疫情报告表明，当前结核病已成为可治性感染疾患中头号致死疾病[1]。到目前为止对结核分枝杆菌的研究已经发现了很多特异性的抗原，但还没有一个单抗原能达到WHO对结核诊断抗原的阳性率要求，即总阳性率大于80%，特异性大于95%[2]。动物实验表明，结核分枝杆菌分泌蛋白Pst S1是比较重要和相对特异的一种抗原，可引起特异的保护性免疫反应。因此，可用作亚单位疫苗。本研究对pst S1基因进行扩增，利用生物信息学方法对该基因进行分析，为构建新型结核疫苗、制造诊断试剂和设计药物靶点提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料
DNA标准分子量marker、2×PCR Master Mix、细菌基因组提取试剂盒、DNA电泳凝胶回收试剂盒购自Promega公司，Agarose购自西班牙，其他试剂均为国产分析纯，结核分枝杆菌为潍坊市第二人民医院患者体内分离。
1.2方法
1.2.1 引物的设计
根据GenBank报道的结核分枝杆菌pst S1基因序列，自行设计特异性引物，序列如下：P1：gtggaattcgtgaaaattcgtttgcat； P2：atactcgaggctggaaatcgtcgcgat。均由上海生物工程公司合成。
1.2.2 结核分枝杆菌基因组DNA的提取
将结核分枝杆菌接种于苏通液体培养基中，37℃培养4周，取3ml培养物80℃，灭活2h，按照细菌基因组提取试剂盒的操作说明操作(该步在市疾病预防控制中心生物安全三级实验室中完成)。
1.2.3 pst S1基因的扩增和生物信息学分析
以MTB基因组DNA为模板，按照常规PCR条件进行扩增。扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，61℃复性1min，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸8min。将扩增出的pst S1基因送上海生物公司进行测序，然后利用DNA Star5. 0软件中对pst S1基因的测序结果进行分析，测其蛋白的二级结构。
2结果
2.1 pst S1基因的测序结果及编码蛋白的分子特征
测序结果表明， 扩增的pst S1基因的全长1112bp， 与GenBank中公布的标准株H37Rv的pst S1基因的核酸序列相比较同源性为92.7%。GC含量为64.95%，编码362个氨基酸。推导出的蛋白分子质量约为38kD，含有74个强碱性氨基酸(K，R)，28个强酸性氨基酸(D，E)，101个疏水性氨基酸(A， I， L， F，W，V)，68个极性氨基酸(N，C，Q， S，T，Y)，等电点为11.989。
2.2pst S1基因编码蛋白结构预测及可读框分析
用Chou-Fasman法分析Pst S1基因编码蛋白的二级结构，可见有11个α螺旋、5个β折叠和32个β转角。一般认为α螺旋、β折叠结构较规则，形态固定，常处于蛋白质的内部；而β转角和无规则卷曲多处于蛋白质的表面，有利于抗体空间构象上与抗原的嵌合，其膜外的β转角可能是具有较强免疫原性的区域，见图1。通过分析还可见该基因含有多个ORF，其中最长的一个是756bp，可能是编码序列。
2.3 pst S1基因的亲水性、疏水性以及抗原性分析
运用生物信息学软件DNAstar6.0的Protean对pst S1基因表达蛋白的亲水性和疏水性预测分析，表明pst S1基因的含有多个较强的亲水区，可能是形成抗原表位的重要部位。用Jameson-Wolf方法抗原性分析显示pst S1有多个明显的具有抗原活性的结构域 ，抗原性指数最强为1.7，结合Hopp-Woods方法进行亲水性分析，表明这些结构域的亲水性普遍较强，二级结构预测显示该基因含有大量β转角结构，结合AMPHI方法预测该基因含有21个免疫优势辅助性T淋巴细胞抗原位点，7个含有特定基序(motif)的潜在T 淋巴细胞抗原决定簇。综合上述分析，表明这个基因可能含有良好的抗原
3讨论
在结核分枝杆菌已发现的特异性抗原中，Pst S1抗原是目前公认的血清学诊断的最佳单抗原，并发展有多个商品化的试剂盒[3]。Pst S1蛋白是一种磷酸盐转运蛋白 [4]，以膜蛋白和分泌蛋白的形式存在，能刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，特异性较强。通过分析发现，该株结核杆菌与GenBank中公布的标准株H37Rv的pst S1基因的核酸序列相比较同源性为92.7%，变异程度较小；该基因编码蛋白含有多个β转角结构，有利于抗体空间构象上与抗原的嵌合；含有多个明显的具有抗原活性的结构域和免疫优势辅助性T 淋巴细胞抗原位点，抗原性较强；并且该菌株的生物学特性与其它株相比基本相同，对常见的抗结核药物具有耐药性。所以该菌株具有一定的代表性，其分泌蛋白不仅可能是治疗结核病的新的切人点，而且有可能作为新型亚单位疫苗用于防止结核病复发。本研究成功扩增了Pst S1基因，为地方结核病的防治以及进一步研究其生物学功能和潜在的临床应用前景奠定了基础。
参考文献：
[1]WHO.Global tuberculosis control：surveillance，planning，finacing[J].Geneva：World Health Organization，2006：242.
[2]Julian E，Matas L，Alcaide J，et al.Comparison of antibody response to a potential combination of specific glycolipids and proteins for test sensitivity improvement in tuberculosis serodiagnosis [J].Clin Diagn Lab Immunol， 2004，11(1)：70-76.
[3]Chaudhary V K，Kulshreshta A，Gupta G，et al.Expression and purification of recombinant 38-kDa and mtb81 antigens of Mycobacterium tuberculosis for application in serodiagnosis [J].Protein Expr Purif，2005，40(1)：169-176.
[4] Bruibunt M，lefevre P，de Wit L，et a1.A mycobacteriumtuberculosis gene cluster encoding proteins of a phosphatehomulogous to the E.coil Pst system [J].Gene，1996，176：171-176. (宋红霞)
关键词：结核分枝杆菌；pst S1基因；扩增；生物信息学
结核病(Tuberculosis， TB )是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis， MTB)所致的、以呼吸系统感染为主的慢性传染病。世界卫生组织全球结核病疫情报告表明，当前结核病已成为可治性感染疾患中头号致死疾病[1]。到目前为止对结核分枝杆菌的研究已经发现了很多特异性的抗原，但还没有一个单抗原能达到WHO对结核诊断抗原的阳性率要求，即总阳性率大于80%，特异性大于95%[2]。动物实验表明，结核分枝杆菌分泌蛋白Pst S1是比较重要和相对特异的一种抗原，可引起特异的保护性免疫反应。因此，可用作亚单位疫苗。本研究对pst S1基因进行扩增，利用生物信息学方法对该基因进行分析，为构建新型结核疫苗、制造诊断试剂和设计药物靶点提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料
DNA标准分子量marker、2×PCR Master Mix、细菌基因组提取试剂盒、DNA电泳凝胶回收试剂盒购自Promega公司，Agarose购自西班牙，其他试剂均为国产分析纯，结核分枝杆菌为潍坊市第二人民医院患者体内分离。
1.2方法
1.2.1 引物的设计
根据GenBank报道的结核分枝杆菌pst S1基因序列，自行设计特异性引物，序列如下：P1：gtggaattcgtgaaaattcgtttgcat； P2：atactcgaggctggaaatcgtcgcgat。均由上海生物工程公司合成。
1.2.2 结核分枝杆菌基因组DNA的提取
将结核分枝杆菌接种于苏通液体培养基中，37℃培养4周，取3ml培养物80℃，灭活2h，按照细菌基因组提取试剂盒的操作说明操作(该步在市疾病预防控制中心生物安全三级实验室中完成)。
1.2.3 pst S1基因的扩增和生物信息学分析
以MTB基因组DNA为模板，按照常规PCR条件进行扩增。扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，61℃复性1min，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸8min。将扩增出的pst S1基因送上海生物公司进行测序，然后利用DNA Star5. 0软件中对pst S1基因的测序结果进行分析，测其蛋白的二级结构。
2结果
2.1 pst S1基因的测序结果及编码蛋白的分子特征
测序结果表明， 扩增的pst S1基因的全长1112bp， 与GenBank中公布的标准株H37Rv的pst S1基因的核酸序列相比较同源性为92.7%。GC含量为64.95%，编码362个氨基酸。推导出的蛋白分子质量约为38kD，含有74个强碱性氨基酸(K，R)，28个强酸性氨基酸(D，E)，101个疏水性氨基酸(A， I， L， F，W，V)，68个极性氨基酸(N，C，Q， S，T，Y)，等电点为11.989。
2.2pst S1基因编码蛋白结构预测及可读框分析
用Chou-Fasman法分析Pst S1基因编码蛋白的二级结构，可见有11个α螺旋、5个β折叠和32个β转角。一般认为α螺旋、β折叠结构较规则，形态固定，常处于蛋白质的内部；而β转角和无规则卷曲多处于蛋白质的表面，有利于抗体空间构象上与抗原的嵌合，其膜外的β转角可能是具有较强免疫原性的区域，见图1。通过分析还可见该基因含有多个ORF，其中最长的一个是756bp，可能是编码序列。
2.3 pst S1基因的亲水性、疏水性以及抗原性分析
运用生物信息学软件DNAstar6.0的Protean对pst S1基因表达蛋白的亲水性和疏水性预测分析，表明pst S1基因的含有多个较强的亲水区，可能是形成抗原表位的重要部位。用Jameson-Wolf方法抗原性分析显示pst S1有多个明显的具有抗原活性的结构域 ，抗原性指数最强为1.7，结合Hopp-Woods方法进行亲水性分析，表明这些结构域的亲水性普遍较强，二级结构预测显示该基因含有大量β转角结构，结合AMPHI方法预测该基因含有21个免疫优势辅助性T淋巴细胞抗原位点，7个含有特定基序(motif)的潜在T 淋巴细胞抗原决定簇。综合上述分析，表明这个基因可能含有良好的抗原
3讨论
在结核分枝杆菌已发现的特异性抗原中，Pst S1抗原是目前公认的血清学诊断的最佳单抗原，并发展有多个商品化的试剂盒[3]。Pst S1蛋白是一种磷酸盐转运蛋白 [4]，以膜蛋白和分泌蛋白的形式存在，能刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，特异性较强。通过分析发现，该株结核杆菌与GenBank中公布的标准株H37Rv的pst S1基因的核酸序列相比较同源性为92.7%，变异程度较小；该基因编码蛋白含有多个β转角结构，有利于抗体空间构象上与抗原的嵌合；含有多个明显的具有抗原活性的结构域和免疫优势辅助性T 淋巴细胞抗原位点，抗原性较强；并且该菌株的生物学特性与其它株相比基本相同，对常见的抗结核药物具有耐药性。所以该菌株具有一定的代表性，其分泌蛋白不仅可能是治疗结核病的新的切人点，而且有可能作为新型亚单位疫苗用于防止结核病复发。本研究成功扩增了Pst S1基因，为地方结核病的防治以及进一步研究其生物学功能和潜在的临床应用前景奠定了基础。
参考文献：
[1]WHO.Global tuberculosis control：surveillance，planning，finacing[J].Geneva：World Health Organization，2006：242.
[2]Julian E，Matas L，Alcaide J，et al.Comparison of antibody response to a potential combination of specific glycolipids and proteins for test sensitivity improvement in tuberculosis serodiagnosis [J].Clin Diagn Lab Immunol， 2004，11(1)：70-76.
[3]Chaudhary V K，Kulshreshta A，Gupta G，et al.Expression and purification of recombinant 38-kDa and mtb81 antigens of Mycobacterium tuberculosis for application in serodiagnosis [J].Protein Expr Purif，2005，40(1)：169-176.
[4] Bruibunt M，lefevre P，de Wit L，et a1.A mycobacteriumtuberculosis gene cluster encoding proteins of a phosphatehomulogous to the E.coil Pst system [J].Gene，1996，176：171-176. (宋红霞)