1000例HBsAg阴性体检人群血清HBV—DNA检测结果研究
摘要：目的：探讨HBsAg阴性体检人群的血清HBV DNA存在状况及其检测的临床意义。方法：选择2010年1月～2012年12月于我院检测HBsAg阴性体检人群的血清样本1000例，采用荧光定量PCR检测其HBV DNA的含量。结果：1000份HBsAg阴性体检人群的血清样品中，HBV DNA阳性41例，阳性率为4.1%；乙肝5项标志物的6种模式中，抗-HBs组HBV DNA检测全部为阴性，抗HBc+HBe阳性组HBV DNA阳性率最高，达13.55%；而HBV全阴性的体检人群血清中仍可检出HBV DNA，阳性率为2.81%。结论：HBsAg阴性体检人群中仍有相当部分存在HBV感染，对该类人群应用PCR筛查其血清中HBV DNA的含量，对于减少漏诊、评价病情进展、指导进一步治疗具有重要指示意义。
关键词：乙型肝炎表面抗原；HBV DNA；荧光定量PCR；带病原状态
近年来HBsAg阴性HBV感染的致病性逐渐受到国内外学者的重视，已经有越来越多的研究证实，HBsAg阴性的隐蔽性HBV感染可导致慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌[1]。随着临床检验技术水平的提高，尤其是PCR技术的日益成熟及广泛应用，在HBsAg阴性人群中发现相当一部分中可以检测到HBV DNA。本文通过荧光定量PCR法检测HBsAg阴性人群的血清HBV DNA的含量，以了解HBV在血清中的存在情况，并探讨其临床意义，现报告如下。
1材料和方法
1.1一般资料：选择我院2010年1月～2011年12月于我院体检，经检测其乙肝标志物(HBVM)中HBsAg为阴性的人群血清样本1000份。所有体检人员无肝炎及其体征，各项肝功能指标正常，并排除其他类型病毒的感染。
1.2仪器与方法：乙型肝炎5项标志物检测采用时间分辨免疫荧光分析法，仪器为芬兰Wallac1235全自动时间分辨免疫荧光分析系统。采用荧光定量PCR检测HBV DNA，仪器为美国ABI公司PE ABI 7300荧光定量基PCR仪，试剂盒由深圳匹基生工工程公司提供并严格按照试剂使用说明书操作。
2结果
1000份HBsAg阴性体检人群的血清样品中，HBV DNA阳性41例，阳性率为4.1%，提示HBsAg阴性并不能排除HBV感染的可能性。乙肝5项标志物的6种模式中，抗-HBs组HBV DNA检测全部为阴性，抗-HBc组阳性HBV DNA检测阳性率为3.18%，抗-HBs+HBe阳性组HBV DNA阳性率6.50%，抗-HBc+HBe阳性组HBV DNA阳性率最高，达13.55%；而HBV全阴性的体检人群血清中仍可检出HBV DNA，阳性率为2.8%，详见表1。
3讨论
很长一段时期内，乙型肝炎表面抗体HBsAg是否阳性被作为诊断乙肝的唯一标志，但在每年有1%的HBsAg阳性携带者自然转阴，而HBsAg阴性的乙型肝炎约占乙肝患者总数的10～25%[2]。近年来，分子生物学技术在病毒检测方面的应用使人们从核酸水平认识了乙型肝炎的病原体，在血清中，即使HBsAg为阴性，运用较高敏感性的荧光定量PCR仍可在这类感染者血清中检测到低水平的HBV DNA，或采用免疫组化在肝组织中也可检测出HBsAg或HBcAg。临床上把血清HBsAg阴性或/和抗-HBs阳性而血清和/或外周血单核细胞中HBV DNA阳性，和/或肝组织HBV抗原，和/或HBV DNA阳性的HBV感染称为隐匿性HBV感染[3]。HBV隐匿性感染可能的因素有[4]：(1)HBV发生基因突变，如S基因变异，个别氨基酸被替代或者缺失，影响了HBsAg的表达或改变了HBsAg的抗原性；(2)患者处于HBV感染恢复早期，体内的HBsAg水平很低因而采用普通酶联免疫吸附试验无法检出；(3)宿主的因素，因HBsAg病毒颗粒的组装或者分泌改变，抑制细胞分泌，或者隐藏于免疫复合物中未检出。我国为HBV高发区，以往研究表明，隐匿性HBV感染也可导致病情发展为慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，因此病源不明的慢性肝病中，不容忽视HBsAg阴性的HBV感染的存在。
酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定HBVM，具有简单、快速、不需贵重仪器等优点，已在临床上得到广泛应用，但ELISA也具有影响因素多、灵敏度低、不能用于定量等缺点，局限了它的应用。时间分辨免疫荧光分析法(Time-resolvedimmnofluorometricassay，TRIFA)是一种近年来新建立的免疫检测技术，同传统的ELISA等技术相比具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，特别适合医学超微量分析。在国外，TRIFA已被广泛应用于各种临床检测，国内应用于乙型肝炎病毒(HBV)血清标志物定量检测还较少[5-6]。
本研究采用时间分辨免疫荧光分析法对乙型肝炎五项标志物进行定量测定，采用荧光定量PCR检测血清中HBV DNA含量，1000例血清样本中HBV DNA阳性有53例，阳性率为5.3%。在乙肝五项标志物6种模式组中，以抗-HBc、抗-HBe阳性组的血清HBV DNA的阳性率最高，为13.5%，HBV全阴性组血清中仍有检出HBV DNA，阳性率为2.81%，这可能是因为在本研究所用测定方法限度内未能检测出，并不意味这些标志物不存在于其血清中。抗-HBs+HBc组和抗-HBc组相比血清HBV DNA阳性率较低(P<0.01)，暗示抗-HBs可能为保护性抗体，而临床上需提高对抗-HBc阳性患者的重视。
总之，使用荧光定量PCR技术可以提高HBsAg阴性体检人群的血清中HBV的检出率，尤其是对抗-HBc+HBe模式的体检人群进行检测，对于减少误、漏诊，正确地评价患者的病情进展，指导进一步的治疗具有重要意义。
参考文献
[1]陈乃玲，朱崇饶，胡德海，等.血清免疫学阴性的乙型肝炎病毒携带者及慢性肝病患者的临床意义[J].中华内科杂志，2002 ，41(10)：653-654
[2]江红，臧国庆，汤正好，等.HBsAg阴性慢性乙型病毒性肝炎患者的临床与病理分析[J].临床内科杂志，2009，26(2)：91-95.
[3]陈善昌，胡静云，等.1000例HBsAg阴性体检人群血清HBV DNA检测分析[J].检验医学与临床，2010，7(2)：140-141
[4]张斌，HBV-DNA，定量检测方法的进展[J].现代诊断与治疗，2002，13(3)：150- 152.
[5]王建，闵福援.乙肝病毒学清标志物的检测方法及其临床意义[J].中华检验杂志2005，28(1)：113.
[6]LaiME，FareiP，FigusA，et al.H epatitis B virusDNA in the sertltn of Sardinian blood donors negalive for the hepatilis B surfacelantigen [J].Blood，2009，93(1)：17：l9 (张桂花)
关键词：乙型肝炎表面抗原；HBV DNA；荧光定量PCR；带病原状态
近年来HBsAg阴性HBV感染的致病性逐渐受到国内外学者的重视，已经有越来越多的研究证实，HBsAg阴性的隐蔽性HBV感染可导致慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌[1]。随着临床检验技术水平的提高，尤其是PCR技术的日益成熟及广泛应用，在HBsAg阴性人群中发现相当一部分中可以检测到HBV DNA。本文通过荧光定量PCR法检测HBsAg阴性人群的血清HBV DNA的含量，以了解HBV在血清中的存在情况，并探讨其临床意义，现报告如下。
1材料和方法
1.1一般资料：选择我院2010年1月～2011年12月于我院体检，经检测其乙肝标志物(HBVM)中HBsAg为阴性的人群血清样本1000份。所有体检人员无肝炎及其体征，各项肝功能指标正常，并排除其他类型病毒的感染。
1.2仪器与方法：乙型肝炎5项标志物检测采用时间分辨免疫荧光分析法，仪器为芬兰Wallac1235全自动时间分辨免疫荧光分析系统。采用荧光定量PCR检测HBV DNA，仪器为美国ABI公司PE ABI 7300荧光定量基PCR仪，试剂盒由深圳匹基生工工程公司提供并严格按照试剂使用说明书操作。
2结果
1000份HBsAg阴性体检人群的血清样品中，HBV DNA阳性41例，阳性率为4.1%，提示HBsAg阴性并不能排除HBV感染的可能性。乙肝5项标志物的6种模式中，抗-HBs组HBV DNA检测全部为阴性，抗-HBc组阳性HBV DNA检测阳性率为3.18%，抗-HBs+HBe阳性组HBV DNA阳性率6.50%，抗-HBc+HBe阳性组HBV DNA阳性率最高，达13.55%；而HBV全阴性的体检人群血清中仍可检出HBV DNA，阳性率为2.8%，详见表1。
3讨论
很长一段时期内，乙型肝炎表面抗体HBsAg是否阳性被作为诊断乙肝的唯一标志，但在每年有1%的HBsAg阳性携带者自然转阴，而HBsAg阴性的乙型肝炎约占乙肝患者总数的10～25%[2]。近年来，分子生物学技术在病毒检测方面的应用使人们从核酸水平认识了乙型肝炎的病原体，在血清中，即使HBsAg为阴性，运用较高敏感性的荧光定量PCR仍可在这类感染者血清中检测到低水平的HBV DNA，或采用免疫组化在肝组织中也可检测出HBsAg或HBcAg。临床上把血清HBsAg阴性或/和抗-HBs阳性而血清和/或外周血单核细胞中HBV DNA阳性，和/或肝组织HBV抗原，和/或HBV DNA阳性的HBV感染称为隐匿性HBV感染[3]。HBV隐匿性感染可能的因素有[4]：(1)HBV发生基因突变，如S基因变异，个别氨基酸被替代或者缺失，影响了HBsAg的表达或改变了HBsAg的抗原性；(2)患者处于HBV感染恢复早期，体内的HBsAg水平很低因而采用普通酶联免疫吸附试验无法检出；(3)宿主的因素，因HBsAg病毒颗粒的组装或者分泌改变，抑制细胞分泌，或者隐藏于免疫复合物中未检出。我国为HBV高发区，以往研究表明，隐匿性HBV感染也可导致病情发展为慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，因此病源不明的慢性肝病中，不容忽视HBsAg阴性的HBV感染的存在。
酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定HBVM，具有简单、快速、不需贵重仪器等优点，已在临床上得到广泛应用，但ELISA也具有影响因素多、灵敏度低、不能用于定量等缺点，局限了它的应用。时间分辨免疫荧光分析法(Time-resolvedimmnofluorometricassay，TRIFA)是一种近年来新建立的免疫检测技术，同传统的ELISA等技术相比具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，特别适合医学超微量分析。在国外，TRIFA已被广泛应用于各种临床检测，国内应用于乙型肝炎病毒(HBV)血清标志物定量检测还较少[5-6]。
本研究采用时间分辨免疫荧光分析法对乙型肝炎五项标志物进行定量测定，采用荧光定量PCR检测血清中HBV DNA含量，1000例血清样本中HBV DNA阳性有53例，阳性率为5.3%。在乙肝五项标志物6种模式组中，以抗-HBc、抗-HBe阳性组的血清HBV DNA的阳性率最高，为13.5%，HBV全阴性组血清中仍有检出HBV DNA，阳性率为2.81%，这可能是因为在本研究所用测定方法限度内未能检测出，并不意味这些标志物不存在于其血清中。抗-HBs+HBc组和抗-HBc组相比血清HBV DNA阳性率较低(P<0.01)，暗示抗-HBs可能为保护性抗体，而临床上需提高对抗-HBc阳性患者的重视。
总之，使用荧光定量PCR技术可以提高HBsAg阴性体检人群的血清中HBV的检出率，尤其是对抗-HBc+HBe模式的体检人群进行检测，对于减少误、漏诊，正确地评价患者的病情进展，指导进一步的治疗具有重要意义。
参考文献
[1]陈乃玲，朱崇饶，胡德海，等.血清免疫学阴性的乙型肝炎病毒携带者及慢性肝病患者的临床意义[J].中华内科杂志，2002 ，41(10)：653-654
[2]江红，臧国庆，汤正好，等.HBsAg阴性慢性乙型病毒性肝炎患者的临床与病理分析[J].临床内科杂志，2009，26(2)：91-95.
[3]陈善昌，胡静云，等.1000例HBsAg阴性体检人群血清HBV DNA检测分析[J].检验医学与临床，2010，7(2)：140-141
[4]张斌，HBV-DNA，定量检测方法的进展[J].现代诊断与治疗，2002，13(3)：150- 152.
[5]王建，闵福援.乙肝病毒学清标志物的检测方法及其临床意义[J].中华检验杂志2005，28(1)：113.
[6]LaiME，FareiP，FigusA，et al.H epatitis B virusDNA in the sertltn of Sardinian blood donors negalive for the hepatilis B surfacelantigen [J].Blood，2009，93(1)：17：l9 (张桂花)